Convegno Annuale della
Associazione Italiana di Colture Cellulari (ONLUS-AICC)

Comunicazioni Orali

01 - IL MANTENIMENTO DELLA OMEOSTASI TISSUTALE: RUOLO DELLA MORTE CELLULARE
Manfredi A.
Università Vita-Salute San Raffaele e Istituto Scientifico San Raffaele, Milano

Il danno a livello dei tessuti viventi è caratterizzato dalla produzione di segnali infiammatori a carattere omeostatico. I segnali omeostatici di necrosi, chiamati anche damage-associated molecular patterns (DAMPS) o allarmine, attraggono e attivano in sede leucociti infiammatori e promuovono la migrazione e la divisione cellulare in modo da rimpiazzare le cellule danneggiate. Dati recenti indicano nelle cellule dell’immunità innata, in particolare nei macrofagi, le prime responsabili nell’integrare i segnali di necrosi in modo da stimolare la funzione dei progenitori e delle cellule staminali richiamati o attivati localmente. I segnali di necrosi attivano inoltre fagociti in grado di presentare l’antigene, quali le cellule dendritiche (DC), in prospettiva del rischio di infezione da parte di microorganismi presenti nell’ambiente.  Le DC attivate vanno incontro a un processo di differenziazione, definito come “maturazione”, che le mette in grado di lasciare i tessuti periferici e raggiungere i linfonodi drenanti. I segnali di necrosi influenzano profondamente le caratteristiche delle DC in periferia: a seconda del codice che le DC ricevono in sede di danno, divengono in grado di causare nei linfonodi l’amplificazione di cloni di linfociti la cui funzione può andare dalla protezione verso patogeni, alla tolleranza, all’infiammazione e autoimmunità cornica, alla riparazione delle ferite. E’ interessante notare come cellule dell’immunità acquisita (un’aggiunta relativamente recente dal punto di vista filogenetico) abbiano sviluppato la capacità di rilasciare dopo attivazione segnali di necrosi nel microambiente, ricreando così un ambiente “necrotico”. Questo meccanismo consente di mantenere nel tempo lo stato attivato e influenza la resistenza all’apoptosi e la funzione dei linfociti attivati. Nel complesso i nostri dati indicano come segnali di necrosi giochino un ruolo chiave nell’omeostasi dell’organismo, consentendo la rigenerazione dei tessuti e la protezione dagli agenti patogeni in condizioni di danno a organi e tessuti.
Bianchi ME, Manfredi AA. Immunology. Dangers in and out. Science. 2009; 323(5922):1683-4; High-mobility group box 1(HMGB1) protein at the crossroads between innate and adaptive immunity. Immunol Rev. 2007;220:35-46.

02 - APOPTOSI, NECROSI E APONECROSI QUANTE FACCE PER UNA MEDAGLIA?
Zecchi Orlandini S.
Dipartimento di Anatomia, Istologia, Medicina Legale – Università di Firenze

The term “aponecrosis” was firstly introduced about ten years ago by our two laboratories (Zecchi-Orlandini/Capaccioli) to indicate a type of cell death, sharing common features with apoptosis and necrosis, which depends on the energy availability of the cell as well as on the expression of typical proto-oncognenes.
Ten years later, what is left about this assumption?
This presentation attempts to delineate the state of the art regarding some aspects in theme of cell death.

03 - RUOLO DEL CAMPO MORFOGENETICO NEI FENOMENI APOPTOTICI DURANTE L’EMBRIOGENESI
Bizzarri M.
Università La Sapienza, Roma

04 - LA MORTE CELLULARE ATTRAVERSO UNA AUTOFAGIA NON-CANONICA
Scarlatti F.
Laboratorio di Endocrinologia Cellulare and Molecolare, Divisione di Endocrinologia e Metabolismo, Dipartimento di Medicina Interna. Università di Torino, Italia

La macroautofagia (qui di seguito chiamata autofagia) è un dinamico ed evolutivamente conservato processo utilizzato per sequestrare il citoplasma di interi organelli in vescicole dotate di doppia membrana, e definite autofagosomi, che fondendosi con il lisosoma degradano il carico autofagico. Recentemente, in cellule tumorali, abbiamo dimostrato l’esistenza di due forme distinte di autofagia: autofagia canonica e autofagia non-canonica. Diversamente dall’autofagia classica o canonica, l’autofagia non-canonica è un processo che per formare l’autofagosoma non richiede l’intero macchinario di proteine coinvolte nell’autofagia (Atg) e in particolare la Beclina 1. Pertanto, l’autofagia non-canonica non è invalidata né dal knock-down della Beclina 1 né dal suo partner di legame, la proteina hVps34. Inoltre, l’overespressione della proteina Bcl-2, che blocca l’autofagia canonica indotta dalla deprivazione di siero, legandosi alla Beclina 1, non contrasta l’autofagia non-canonica indotta dal resveratrolo (un polifenolo naturale) nelle MCF-7. Le MCF-7, una linea cellulare del carcinoma mammario umano, sprovviste dell’attività della caspasi-3, sono refrattarie alla morte cellulare apoptotica in seguito al trattamento con il resveratrolo. Di conseguenza, almeno nelle MCF-7, l’autofagia non-canonica è coinvolta nella morte cellulare caspasi-indipendente indotta dal resveratrolo.
Ringraziamenti: Patrice Codogno dell’INSERM U756, Faculté de Pharmacie, Université Paris-Sud 11, 92296 Châtenay-Malabry, Francia e Riccardo Ghidoni, Laboratorio di Biochimica e Biologia Molecolare del Dipart.di Medicina, Ospedale San Paolo, Università di Milano, Italia.

05 - ANOIKIS: UN TIPO DI MORTE CELLULARE INDOTTA DA UN INIBITORE DELLA V-H-ATPASE IN LINEE DI CARCINOMA DEL COLON
Supino R.
Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori, via Venezian 1, 20133 Milano, Italia

Le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice sono implicate non solo nella trasformazione maligna, ma anche nei processi invasivi e metastatici e nella morte cellulare in quanto alla base di una apoptosi anoikis-mediata. La loro modulazione, così come l’induzione di anoikis, potrebbero quindi avere implicazioni terapeutiche.
Noi abbiamo indotto anoikis in cellule di carcinoma del colon mediante trattamento con inibitori delle Vacuolar-H+-ATPasi (V-ATPasi), enzimi localizzati sulle membrane intracellulari e plasmatiche delle cellule eucariotiche, responsabili del mantenimento del pH intracellulare. Infatti le V-ATPasi giocando un ruolo critico nell’equilibrio cellulare dei protoni proteggono la cellula dall’acidificazione prodotta nelle cellule tumorali dal metabolismo glicolitico, contribuiscono alla resistenza all’apoptosi, alla farmaco resistenza e alla capacità invasiva e metastatica delle cellule. NiK-12192 (Nikem Research, Milano, Italia), un inibitore delle V-ATPasi, causa una riduzione del volume e/o acidità dei lisosomi, una polarizzazione della distribuzione della integrina avb5, e un consistente numero di cellule vive e staccate dal substrato. Segnali di apoptosi si osservano solo dopo 72h di trattamento. Quindi, NiK-12192, interagendo sulla attività della V-ATPasi (e quindi del pH intracellulare) può causare una modificazione di strutture cruciali per l’adesione cellulare e indurre morte cellulare con una modalità mediata da anoikis.
Ringraziamenti: Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalla Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, Milano, Italia.

06 - APOPTOSIS IN MICROGRAVITY
Monici M.
ASAcampus Joint Laboratori, ASA res. Div, Dip. Clinical Physiopathology, University of Florence

Gravitational alterations may have relevant effects on cell behaviour. Cell response to mechanical/gravitational stresses implies changes in morphology and function. A relationship seems to exist between reorganization of cell structures and integration of signal pathways leading to the modulation of gene expression.
Mechanotransduction, the process of translating external forces acting on a cell into a biological response, remains mostly unknown. Over the past decade, in vitro studies have indicated that mechanotransduction involves the extracellular matrix,  integrins, calcium channels, guanosine triphosphatases (GTPases), mitogen-activated protein kinases (MAPKs), etc., but  cytoskeleton plays a central role, orchestrating multiple signal pathways that regulate major cell functions, such as proliferation,  differentiation, apoptosis, adhesion and motility. Cell shape appears to be a critical determinant of cell function, because it is the resultant of an underlying balance of mechanical forces that in turn convey critical regulatory information to the cell.
In unloading conditions, the occurring cytoskeletal alterations are considered the major responsible for the strong increase in apoptosis described by many authors in a variety of cell types: osteoclastic precursors, lymphocytes, endothelial, glial and tyroid cells, etc...
In cells exposed to microgravity, mitochondrial damage induced by cytoskeletal disorganization and overexpression of Bax  have been observed, supporting the hypothesis that  the intrinsic pathway is involved. It is well known that Bax is a pro-apoptotic factor responsible for pore formation in mitochondrial membranes and permeabilization of the outer mitochondrial membrane is followed by release of proapoptotic proteins, able to activate caspases and then the apoptotic cascade. Moreover, the death receptor Fas and its ligand FasL have been found overexpressed, suggesting that also the extrinsic pathway is triggered.
However, in prolonged exposure (over 20 h) to altered gravitational conditions, at least a fraction of the exposed cell population seems to be able to reorganize the cytoskeletal structures and adapt their behaviour to the new conditions.
To increase our knowledge on the regulation of apoptosis by impact of mechanical/gravitational stresses on cell niche and cell cytoskeleton could be of consequence in many fields of biomedical research, from tissue engineering and regeneration to cancer treatment.
The speaker thanks:
-the other members of her research group Francesca Cialdai, Giovanni Romano, Franco Fusi, Antonio Conti, who are coauthors of many papers describing the studies here reported;
-the researchers Augusto e Marianne Cogoli, Daniela Grimm, Lucia Morbidelli, Nicola Marziliano, Susanna Benvenuti, Bianca Maria Uva, Maria Angela Masini, for collaboration.

07 - DANNO CELLULARE DA RADIAZIONI
M. Balzi, A. Becciolini
Sezione di Biologia Cellulare e Radiobiologia, Dipartimento di Fisiopatologia Clinica, Università degli Studi, Firenze

Il danno da radiazioni è stato studiato su cellule e tessuti nell’uomo e negli animali da laboratorio per definire le condizioni ottimali di applicazione in radioterapia. Immagini di apoptosi da radiazioni sono riportate a partire dagli anni ’20 e dimostravano gli effetti di basse dosi su tessuti ad elevata attività proliferativa. Questo gruppo di ricerca ha analizzato con varie metodologie il danno intestinale da radiazioni a livello qualitativo e quantitativo anche al fine di spiegare i meccanismi che portano allo stato di malassorbimento nei pazienti irradiati sull’addome. Sono stati studiati gli effetti di dosi subletali e letali di radiazioni sia dal punto di vista morfologico quantitativo che biochimico-funzionale. In un recente esperimento sui topi con una dose sovraletale è stato valutato l’effetto di somministrazioni, prima e immediatamente dopo l’esposizione, di TGFβ3 e IL11. I risultati hanno dimostrato che tutti gli animali trattati sopravvivono, mentre quelli solo irradiati muoiono per danno intestinale. Le analisi hanno dimostrato che il risultato è dovuto alla maggiore efficienza della riparazione-ripopolazione.

08 - APOPTOSI E CAMPI ELETTROMAGNETICI
Ghibelli L.
Università degli Studi di Roma “Tor Vergata”

Magnetic fields (MF) include a huge set of electromagnetic radiations of different frequencies that interact with living matter through still unclear mechanisms. If potential therapeutic applications are documented since Mesmer’s time in 18th century, and concern for possible harmful effect of domestic or occupational exposure was acknowledge since about 40 years, mechanistic analysis that may explain these broad range phenomena that affect, for good or for bad, human health have remained neglected for long time. On the one side, the current biophysical theory suggests that MF interfere with biological processes by affecting stability of radical pairs resulting from enzymatic hydrolysis processes. On the other, many biological experimental studies demonstrated that MF affect dynamic processes such as inflammatory cell activation, or tissue healing, whereas more static tissues/cells remain relatively unaffected. It is emerging that MF affect ongoing cellular processes rather than creating new ones, modulating signal transduction efficiencies, possibly performing a signaling, in addition to a stressor, role. We show here that MF activate a pro-survival pathway requiring pertussis toxin-sensitive G proteins and phospholipase C. This, possibly via a diacylglycerol lipase-involving step, liberates nitric oxide thereby activating plasma membrane Ca2+ channels of the non-capacitative type. The non-capacitative Ca2+ entry (NCCE) is required for this novel MF-induced, NO-dependent survival pathway, that we could mimic with the NO donor nitrosoglutathione; MF or GSNO indeed interfere with the apoptotic process, and allow clonal cell survival to cells challanged with damaging insults. Survival of damaged, possibly mutated cells provide a rationale to the well-established tumor promoting role of MF.

09 - APOPTOSIS INDUCED BY SPHAEROPHORIN AND PANNARIN, LICHEN METABOLITES, ON HUMAN MELANOMA CELLS
Caggia S.1, Russo A.2, Bevelacqua Y.1, Stivala F.3, Mazzarino M.C.3, Cardile V.1
1)Department of Physiological Sciences, University of Catania, V.le A. Doria 6, 95125, Catania, Italy 2)Department of Biological Chemistry, Medical Chemistry and Molecular Biology, University of Catania, V.le A. Doria 6, 95125, Catania, Italy
3)Department of Biomedical Sciences, University of Catania, Vai Androne 83, 95124 Catania
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Introduction
Lichens are complex symbiotic organisms of fungi and algae and their metabolites have long been used by humans. These compounds, which comprise aliphatic, cycloaliphatic, aromatic, and terpenic compounds, are unique with respect to those of higher plants and show interesting biological and pharmacological activities. Melanoma is an aggressive, therapy-resistant malignancy of melanocytes. Currently, there is no effective long-term treatment for patients suffering from the advanced stages of this cancer. It is therefore of primary interest to search for new therapeutic agents that are able to prevent and contrast this aggressive tumor.

Aims
The growth inhibitory activity of two lichen compounds, sphaerophorin (depside) and pannarin (depsidone), against human melanoma cell line M14 was evaluated.

Methods
MTT assay was performed to quantify cell viability and proliferation in melanoma cells M14, mantained in absence or presence of sphaerophorin and pannarin at different concentrations (6-50 mM) for 72 hr. Lactic dehydrogenase (LDH) release in the culture medium was spectrophotometrically measured to examine the membrane permeability. Nuclear DNA fragmentation was analyzed using the COMET assay, a sensitive method for detecting DNA strand break in individual cells. The activity of caspase-3 was determined by using the caspase colorimetric assay kit and reactive oxygen species (ROS) determination was performed by using a fluorescent probe 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA).

Results
The data obtained show that sphaerophorin and pannarin inhibit the growth of melanoma cells, inducing an apoptotic cell death, demonstrated by fragmentation of genomic DNA (COMET assay) and by a significant increase of caspase-3 activity, and correlated, at least in part, to the increase of ROS generation.

Conclusions
The results confirm the promising biological proprieties of sphaerophorin and pannarin and may offer a further impulse to the development of analogues with more potent efficacy against melanoma cells.

10 - BIOTOSSINE ALGALI CON DISTINTI MECCANISMI MOLECOLARI D’AZIONE INDUCONO MORTE CELLULARE CON  PROCESSI CONVERGENTI SU MODIFICHE DEI PATTERN DI FOSFORILAZIONE NEL SISTEMA HSP 27
Sala G.L., Bellocci M., Rossini G.P.
Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Modena e Reggio Emilia, Via Campi 287, I-41125 Modena

Introduzione
Le tipologie di morte cellulare sono distinguibili con marker molecolari e ultrastrutturali. Le differenze, tuttavia, non sono assolute e la complessità del quadro indica l’esistenza di elementi di convergenza fra diversi meccanismi molecolari di morte cellulare.
L’acido okadaico (AO) e la palitossina (PlTX) sono sostanze naturali con potente attività biologica, distinguibili sia per struttura chimica che per meccanismo d’azione. L’AO agisce inibendo le maggiori fosfoproteine fosfatasi, mentre la PlTX converte la Na+,K+-ATPasi membranaria in un canale cationico non selettivo. Entrambe le tossine, tuttavia, causano morte cellulare con modalità che sono note solo in parte.

Scopi
In questo studio abbiamo utilizzato un modello sperimentale di cellule umane in coltura per studiare i meccanismi molecolari di tossicità di AO e PlTX, valutando se le risposte di morte cellulare indotte dalle due diverse tossine comprendano componenti molecolari condivisi.

Metodi
L’indagine è stata condotta a livello sistemico, individuando le modifiche indotte da AO e PlTX nel proteoma di cellule MCF-7. La caratterizzazione di risposte coinvolgenti proteine di rilievo ha compreso analisi mediante immunoblotting.

Risultati
L’analisi proteomica di estratti cellulari totali ha mostrato che il livello di espressione di trenta proteine è significativamente alterato in cellule MCF-7 esposte ad AO. Le proteine coinvolte nella risposta comprendono diverse isoforme di hsp 27. Analisi di hsp 27 mediante immunoblotting dopo separazione con elettroforesi bidimensionale hanno mostrato che cellule MCF-7 contengono basse concentrazioni di due isoforme fosforilate in Ser82 in condizioni basali, i cui livelli aumentano in seguito al trattamento con AO. Queste medesime isoforme sono aumentate anche in cellule MCF-7 esposte a PlTX. Altre due isoforme di hsp 27 fosforilate in Ser82 sono rilevabili mediante immunoblotting di estratti preparati da cellule esposte ad AO.

Discussione
I risultati ottenuti mostrano che i meccanismi molecolari mediante i quali AO e PlTX inducono la morte di cellule MCF-7 convergono verso la stabilizzazione di alcune isoforme di hsp 27, caratterizzabili da specifici set di fosforilazioni comprendenti il residuo Ser82. I nostri risultati indicano che il destino cellulare nel nostro modello sperimentale è controllato dai livelli relativi delle diverse isoforme fosforilate di hsp 27.

Ringraziamenti: Queste indagini sono sostenute dal MUR (finanziamento 2007FXSCL2)

11 - IL CONTRIBUTO DELL’AUTOFAGIA NELL’APOPTOSI INDOTTA DA CISPLATINO IN CELLULE DI MELANOMA: SINERGIA O PROTEZIONE?
Del Bello B., Toscano M., Moretti D., Maellaro E.
Dipartimento di Fisiopatologia, Medicina Sperimentale e Sanità Pubblica, Sez. Patologia Generale - Università di Siena

Introduzione
Dati della letteratura hanno evidenziato che le cellule tumorali rispondono a numerosi trattamenti citotossici inducendo autofagia come meccanismo protettivo; tuttavia è stato anche dimostrato che l’autofagia è parte integrante del meccanismo citotossico di alcuni farmaci. Pertanto a tutt’oggi non è chiaro il contributo dell’autofagia nella morte per apoptosi di cellule tumorali.

Risultati
In questo studio, condotto su cellule di melanoma umano metastatico Me665/2/21 indotte in apoptosi dal cisplatino, si evidenzia un ruolo anti-autofagico di questo agente genotossico, come dimostrato dalla diminuzione del rapporto LC3II/LC3I, tipico marker di autofagia. Parallelamente si osserva una diminuita espressione di beclina-1 in cellule sia pre-apoptotiche che apoptotiche; tale  diminuzione è parzialmente reversibile in presenza dell’inibitore delle caspasi-3/-7, DEVD-CHO, e si accompagna a formazione di un frammento di 50 kDa nelle cellule in apoptosi avanzata. Per capire se questa diminuita autofagia concorra alla morte apoptotica da cisplatino o, viceversa, vi si opponga, abbiamo co-trattato le cellule con un classico inibitore della prime fasi dell’autofagia, la 3-Metiladenina (3-MA), inibitore di PI3K-classe III: il risultante aumento, seppur lieve, dell’entità della morte cellulare suggerisce un ruolo protettivo dell’autofagia nella morte per apoptosi.
In una prospettiva farmacologica di terapia combinata, abbiamo studiato la risposta citotossica al cisplatino in condizioni in cui l’autofagia viene stimolata, utilizzando il CCI-779, un estere dell’inibitore specifico di mTOR, rapamicina. La somministrazione di CCI-779 (1 nM -10 mM) non induce apoptosi ma produce solo un lieve effetto citostatico.  Al contrario, il trattamento con  CCI-779 + cisplatino aumenta considerevolmente l’apoptosi indotta dal solo cisplatino. L’analogo della rapamicina, come atteso, è un buon induttore di autofagia,  valutata come progressivo aumento della ratio LC3II/LC3I; anche in questo caso il cisplatino tende a diminuire l’autofagia indotta da CCI-779. La 3-MA, pur essendo efficace nel diminuire la ratio LC3II/LC3I, non modifica l’entità della apoptosi, suggerendo che l’effetto sinergico da CCI-779 sulla  morte cellulare non è dovuto all’induzione di autofagia.
Come da noi dimostrato in precedenza, il trattamento con cisplatino provoca attivazione di calpaine, che contribuiscono alla morte per apoptosi, e la cui inibizione (con MDL-28170 e calpeptina) esercita un effetto anti-apoptotico. In questo studio si evidenzia che l’inibizione delle calpaine induce anche un notevole incremento di autofagia, anche in questo caso, così come sulle cellule controllo e sulle cellule trattate con CCI-779, ridimensionato dal cisplatino. In queste condizioni, in cui l’aumento di autofagia si associa a protezione dalla morte, il trattamento con 3-MA inibisce l’autofagia e nel contempo attenua la protezione.

Conclusioni
Nel complesso i dati suggeriscono che l’autofagia, sia costitutiva che farmaco-indotta, non concorre alla morte per apoptosi, piuttosto svolge un ruolo proteggente.

12 - IL RUOLO DELL’AUTOFAGIA APOPTOSI-INDIPENDENTE IN CELLULE DI OSTEOSARCOMA UMANO FARMACORESISTENTI
Condello M.1, Lista P. 1, Federici E. 2, Arancia G. 1 and Meschini S. 1
1Dipartimento di Tecnologie e Salute e 2 Dipartimento del Farmaco, Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena 299, Roma, Italia.

Introduzione
Sebbene i protocolli chemioterapici convenzionali negli ultimi anni abbiano raggiunto notevoli progressi, migliorando la sopravvivenza e la qualità di vita dei pazienti, gli studi nel settore oncologico proseguono con il costante impegno di comprendere i meccanismi alla base della farmacoresistenza delle cellule tumorali e di mettere a punto nuove strategie terapeutiche, con limitati effetti collaterali, per il superamento di questo complesso fenomeno. Nostri precedenti studi (Meschini et al. 2003, 2005) hanno dimostrato che l’alcaloide vegetale voacamina (VOA) è in grado di sensibilizzare cellule di osteosarcoma umano farmacoresistenti (U-2 OS/DX) all’azione citotossica della doxorubicina esercitando un’azione competitiva nei confronti della P-glicoproteina (Pgp).

Scopi
In questo studio si è voluto valutare l’effetto della VOA, non solo come agente chemiosensibilizzante somministrato a concentrazioni subcitotossiche in associazione con chemioterapici convenzionali, ma anche come agente citotossico, se usato da solo a concentrazioni maggiori. E’ stato dimostrato che la morte cellulare indotta dalla VOA non è attivata dall’induzione del pathway apoptotico, bensì di quello autofagico.

Metodi
A tale scopo sono state impiegate tecniche di immunocitochimica, microscopia elettronica a trasmissione e scansione, citofluorimetria a flusso, western blotting e RNA interference.

Risultati e discussione
Le prove sperimentali che l’effetto citotossico della VOA non è dovuto all’induzione dell’apoptosi derivano dalle osservazioni della morfologia dei nuclei, ben preservati, dall’assenza del picco subG1 nel profilo citofluorimetrico del ciclo cellulare e dalla scarsa esposizione della fosfatidilserina sulla superficie cellulare e, infine, dallo studio dei principali marker biochimici (PARP, Bcl-2). Per escludere che l’induzione della morte autofagica sia una risposta generale della linea cellulare e non dovuta in maniera specifica al trattamento con VOA, le cellule di osteosarcoma sono state trattate con doxorubicina e staurosporina, noti induttori di apoptosi. Entrambi gli agenti hanno dimostrato la tendenza delle cellule di osteosarcoma ad andare in apoptosi.
Le prime indicazioni sul coinvolgimento dell’autofagia derivano dalle osservazioni al microscopio elettronico a trasmissione di cellule trattate con VOA, le quali presentano numerosi vacuoli autofagici, contenenti organelli e materiale in fase di degradazione. Esse sono state confermate andando a valutare l’espressione della proteina LC3, nota molecola associata agli autofagosomi, e la conversione dalla forma LC3-I (citosolica) alla forma LC3-II, legata alla membrana dell’autofagosoma. Tale conversione veniva notevolmente ridotta pretrattando le cellule con noti inibitori dell’autofagia. Inoltre, il silenziamento dei principali geni autofagici (ATG5, ATG6, ATG7, ATG12) riduceva in maniera significativa la citottossicità indotta dalla voacamina, rafforzando l’ipotesi che tale alcaloide induce morte cellulare autofagica sulle cellule di ostesarcoma umano farmacoresistenti e pertanto rappresenta un promettente agente chemioterapico.

13 - RUOLO DELL’APPARATO DEL GOLGI  NELL’APOPTOSI INDOTTA DA DOXORUBICINA LIPOSOMIALE NON PEGILATA IN CELLULE DI CARCINOMA DELLA PROSTATA ORMONO-REFRATTARIO
Fabbri F.1, Carloni S.1, Brigliadori G.1, Ulivi P.1, Tesei A.1, Montanari M.2, Amadori F.1, Zoli W.1
1Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori, Meldola; 2Oncology Unit, Ravenna Hospital, Ravenna, Italy

Introduzione - Scopi
L’efficacia terapeutica degli attuali trattamenti per il carcinoma della prostata ormono-refrattario è insoddisfacente e ciò rende indispensabile la ricerca di nuovi farmaci o strategie terapeutiche innovative. Obiettivi principali di questo lavoro sono la valutazione, in vitro, dell’attività e dei meccanismi d’azione di doxorubicina liposomiale non pegilata in cellule di carcinoma della prostata ormono-refrattario.

Metodi
Sono state utilizzate 2 linee cellulari di carcinoma della prostata ormono-refrattario, DU145 e DU145-R. Le cellule DU145 sono state ottenute dall’ATCC, mentre la linea DU145-R è stata ottenuta esponendo le cellule DU145 a concentrazioni crescenti di docetaxel per un mese. L’IG50 del docetaxel nella linea DU145-R è 1,5 volte più alta rispetto a quella rilevata nelle cellule DU145.  L’attività di doxorubicina (Doxo) e doxorubicina liposomiale non pegilata (Myocet®) è stata valutata mediante test SRB, l’induzione di apoptosi tramite saggio TUNEL. L’incorporazione e la localizzazione intracellulare del Myocet sono state analizzate mediante microscopia, l’espressione di CD95 e di GD3 tramite citofluorimetria, l’alterazione di marcatori proteici mediante western blot.

Risultati
Myocet ha dimostrato un’attività citotossica superiore a quella della Doxo in entrambe le linee cellulari, inducendo apoptosi nel 70% delle cellule dopo 72 ore di esposizione, già a concentrazioni pari ad  1/10 del picco plasmatico. Il farmaco si concentra principalmente nell’apparato del Golgi e induce un significativo incremento dell’espressione del recettore di morte CD95, del ganglioside GD3 e delle forme attive delle caspasi -2, -3 e -8. Myocet induce un decrescita dell’espressione della proteina anti-apoptotica Mcl-1, in modo più evidente nella linea DU145.

Discussione
Myocet ha dimostrato una notevole attività citocida sulle cellule di carcinoma della prostata ormono-refrattario, presumibilmente in seguito al raggiungimento di un’alta concentrazione intracellulare localizzata principalmente nell’apparato del Golgi. Agendo come sensore di stress cellulare, l’apparato del Golgi può potenziare l’effetto pro-apoptotico convenzionale indotto da antracicline, dipendente dal danno al DNA, promuovendo un incremento di espressione di CD95, GD3 e della forma attiva della caspasi-2. I nostri dati rafforzano l’ipotesi che l’induzione di morte cellulare possa esplicarsi anche attraverso organelli cellulari diversi dai mitocondri e che l’apparato del Golgi potrebbe essere un obiettivo ideale per la terapia antitumorale. L’attività del Myocet nelle cellule DU145-R raccomanda un approfondimento clinico di tale formulazione per il trattamento di seconda linea nei pazienti di carcinoma della prostata ormono-refrattario in progressione dopo docetaxel.

14 - IL RECLUTAMENTO DELL’ANTIGENE CD99 INDUCE APOPTOSI NELLE CELLULE DI SARCOMA DI EWING ATTRAVERSO L’ATTIVAZIONE DI P53
Guerzoni C., Garofalo C., Manara M.C., Picci P. e Scotlandi K.
Laboratorio di Oncologia Sperimentale, Istituto Ortopedico Rizzoli, Via di Barbiano 1/10, 40136 Bologna

Introduzione
Il CD99 è una glicoproteina di membrane di 32 KDa, la cui espressione è costantemente associata ad una classe di tumori ossei infantili caratterizzati da scarsa  prognosi, Ewing’s Sarcomas Family of Tumors (EWSFT). Il ruolo di questo antigene non è ancora stato completamente delucidato, tuttavia l’impiego di anticorpi specifici rivolti contro il CD99 ne hanno agevolato lo studio funzionale e molecolare, richiamando l’attenzione alle specifiche vie di trasduzione del segnale ed identificandolo come promettente target nella terapia del sarcoma di Ewing.

Scopi e Metodi
Al fine di chiarire i meccanismi molecolari responsabili dell’attivazione del processo apoptotico nelle cellule di sarcoma di Ewing (SE) stimolate con anticorpi monoclonali rivolti verso il CD99, abbiamo valutato gli effetti dell’anticorpo 0662 tramite analisi Microarray e Phosphoarray. Successivamente sono state effettuate validazioni specifiche attraverso western blotting in svariate linee cellulari di sarcoma di Ewing.

Risultati
Il reclutamento del CD99 è in grado di modulare numerosi processi biologici quali: I) adesione; II) migrazione e metastasi; III) regolazione del ciclo e del signaling cellulare; IV) apoptosi e death receptor signaling. I risultati ottenuti concordano con dati precedentemente pubblicati sugli effetti dell’anticorpo 0662 in vitro ed in vivo (Scotlandi et al. 2000): l’anti-CD99 mAb induce, infatti, aggregazione omotipica e rapida induzione di morte cellulare delle cellule Sarcoma di Ewing, con conseguente inibizione della crescita e riduzione del potenziale metastatico e clonogenico. In seguito a trattamento con 0662, si evidenzia il reclutamento di p53 e del suo regolatore di stabilità, MDM2, piuttosto che una diretta attivazione delle caspasi. Inoltre si evidenzia una maggior suscettibilità all’apoptosi nelle linee p53+/+ o con mutazioni puntiformi p53 piuttosto che linee con alterazioni grossolane della proteina TP53; in queste ultime, a differenza delle prime, non si riscontra espressione di target specifici di p53 (p21, BAX). Infine il coinvolgimento di p53 spiegherebbe la  maggior suscettibilità su tumori primitivi e metastasi del trattamento combinato con snticorpi monoclonali anti-CD99 e Doxorubicina (Scotlandi et al. 2006).

Discussione
La miglior comprensione dei meccanismi molecolari fisiopatologici del Sarcoma di Ewing e del ruolo dell’antigene CD99 potrebbe consentire di stabilire nuove combinazioni di terapie molecolari mirate al potenziamento della risposta apoptotica scatenata da 0662 mAb nella terapia del Sarcoma di Ewing, come ad esempio inibitori dell’interazione p53-MDM2.

Ringraziamenti: Fabiola Moretti, Ludwig Schaefer.

15 - IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A NOVEL IKAROS SPLICE VARIANT AND ITS INVOLVEMENT IN APOTOSIS
Capece D, Mancarelli MM, Iansante V, Verzella D, Fischietti MM, Di Tommanso A, Di Ianni M, Zazzeroni F, Gulino A, Alesse E.
Università degli Studi de L’Aquila, Dipartimento di Medicina Sperimentale, via Vetoio, 67100- L’Aquila

Ikaros is a Krüppel-like zinc-finger transcription factor involved in the regulation of hemopoiesis; in fact, this protein plays a key role  in the control of proliferation and differentiation of the lymphoid lineage. The Ikaros gene encodes a family of functionally diverse transcription factors derived from alternative splicing of pre-mRNA. The short splice variants bind the DNA-binding isoforms and exert a dominant negative effect by inhibiting their binding to the target promoters of lymphoid-related genes.
Ikaros is a tumor suppressor gene that negatively regulates cell cycle; inactivating mutations in this gene or the over-expression of dominant negative forms of Ikaros (DN) are associated with the development of lymphoproliferative disorders, because of an up-regulation of proliferation and survival signals. Particularly, the research is increasingly focusing on the deregulation of alternative splicing of pre-mRNA of Ikaros, this event being implicated in the initiation and progression of several forms of leukemia.
In the peripheral blood lymphocytes (PBL) we have isolated a new Ikaros splice variant, structurally related to the dominant negative isoforms, which we called Ikaros N. We have found that Ik-N is able to functionally inhibit Ikaros DNA-binding isoforms, in part by their cytoplasmic sequestration. We have evaluated the biological effects of Ik-N over-expression both in terms of cell proliferation and cell death; particularly Ik-N promotes cell proliferation and its over-expression is associated with enhanced protection against apoptosis. Finally, in order to clarify the patogenetic role of Ik-N in  hematological malignancies we have investigated the mRNA expression of this DN isoform in samples from patients with lymphoproliferative disorders.
The understanding of the molecular mechanisms underlying the genesis of hematological malignancies is crucial to identify new diagnostic tumor markers and new targets for cancer therapy.

16 - APOPTOSI E AUTOFAGIA NELLE MALATTIE NEURODEGENERATIVE
Forloni G.
Dipartimento di Neuroscienze, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Via G. La Masa – Milano

Le principali malattie neurodegenerative sono caratterizzate da una vulnerabilità selettiva di specifici sistemi neuronali, il sistema colinergico basocorticale e ippocampale nell’Alzheimer (AD), quello nigro-striatale nel Morbo di Parkinson (PD), i motoneuroni nella Sclerosi Laterale Amiotrofica e i neuroni striatali nella corea di Huntington. Tuttavia a fronte di questa relativa specificità, confermata anche dagli studi più recenti, i meccanismi di base proposti per spiegare il processo neurodegenerativo sono spesso comuni, tra questi la presenza del misfolding proteico e di un ruolo patogenetico degli aggregati di specifiche proteine è quello evidenziato più recentemente. L’accumulo di proteine può avvenire a livello intra o extra– cellulare, o addirittura intranucleare. Il coinvolgimento degli aggregati proteici nel processo neurodegenerativo è più evidente nell’accumulo extracellulare di β amiloide in AD e, a livello citoplasmatico, della α-sinucleina nei corpi di Lewy che caratterizzano il PD. Nelle malattie neurodegenerative la morte delle cellule nervose è un fenomeno fondamentale ma che avviene molto a valle nel processo patologico che, tranne poche eccezioni, si sviluppa nel corso di anni o di decenni. In passato abbiamo dimostrato che l’esposizione di neuroni a peptidi β amiloide induceva una morte per apoptosi, studi successivi hanno caratterizzato nel dettaglio il fenomeno che è stato confermato anche da evidenze neuropatologiche. Più recentemente sono stati identificati piccoli aggregati di β amiloide solubili, gli oligomeri, come responsabili dei fenomeni neurodegenerativi. Tuttavia accanto alla disfunzione neuronale attivata dagli oligomeri dall’esterno della cellula, un certo rilievo stanno avendo i meccanismi intracellulari, la cui attivazione dipende sempre dagli oligomeri di β amiloide e che coinvolge il sistema autofagosoma.lisosomiale. Sembra infatti che la distrofia dei neuriti, un evento precoce in AD, correli con un aumento dei vacuoli autofagici, ad indicare una perdita di efficienza di questo sistema di degradazione. Nel PD, poiché l’accumulo di α-sinucleina avviene a livello intracellulare, la compromissione dei sistemi degradativi dei principali sistemi proteolitici associata allo stress ossidativo è ritenuta il fenomeno patogenetico più rilevante. A lungo ci si è concentrati sul ruolo del sistema ubiquitina proteosoma (UPS) che risulta compromesso in PD, sia per alterazioni dirette di origine genetica che indirette dovute ad una ridotta attività mitocondriale. Poiché il sistema autofagico riesce a compensare un’inefficiente degradazione proteica ad opera di UPS, è probabilmente da un cattivo funzionamento di entrambi i sistemi che si arriva all’accumulo di α-sinucleina. In accordo con questa indicazione, in un sistema cellulare dove la produzione di α-sinucleina, viene indotta, noi abbiamo dimostrato che il blocco del sistema macroautofagico ma non quello dell’UPS produce un accumulo della proteina e morte cellulare. In generale sempre più evidenze attribuiscono al sistema lisosomiale autofagico un ruolo rilevante nello sviluppo dei fenomeni neurodegenerativi, l’approfondimento di questo fenomeno può aprire nuove prospettive terapeutiche in un contesto estremamente carente di approcci efficaci.

17 - ROLE OF TGF-B IN THE DEVELOPMENT OF HUMAN TH17
Santarlasci V., Maggi L., Capone M., Frosali F., Querci V., Liotta F., Cosmi L., Maggi E., Romagnani S., Annunziato F.
Centre of Excellence DENOthe, University of Florence, Italy

The adaptive effector CD4+ Th-mediated immune response is highly heterogenous, based on the development of distinct subsets which are characterized by different profiles of cytokine production. Initially, two polarized forms of Th effectors, named as Th1 or Th2, were identified in both mice and humans. Th1 cells produce IFN- g and are mainly devoted to the protection against intracellular microbes, whereas Th2 cells produce IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13 and are involved in the protection against gastrointestinal nematodes, but are also responsible for allergic disorders. More recently, a third subset of CD4+ effector T cells which produce IL-17 has been described in mice, which was named as Th17 afterwards. At least in mice, Th17 cells seem to provide protection against infections by extracellular bacteria and fungi, but their major role appears to be the involvement in the pathogenesis of chronic inflammatory disorders, including some murine models of autoimmune diseases. Recently, by using the microarray assay we found that CD161 was one of the most up-regulated genes in human Th17, in comparison with Th1 or Th2, clones. Accordingly, T-blasts from all Th17 clones expressed CD161 on their surface, whereas all Th1 or Th2 clones examined were CD161-. All IL-17-producing cells were found to be included within the CD161+ fraction of adult circulating CD4+ T cells. When CD161+ or CD161- cells were sorted  from umbilical cord blood (UCB) naïve CD4+ T cells and activated in presence of IL-1b plus IL-23, Th17, Th17/Th1 or Th1 cells developed from the CD161+ fraction, whereas CD161- cells could never been induced to differentiate into IL-17- producing cells.
Human Th17 clones and circulating Th17 cells showed lower susceptibility to the anti-proliferative effect of TGF-b than Th1 or Th2 clones or circulating Th1- or Th2-oriented T cells, respectively. Accordingly, human Th17 cells exhibited lower expression of clusterin, and higher Bcl-2 expression and reduced apoptosis in presence of TGF-b in comparison with Th1 cells. Umbilical cord blood (UCB) naïve CD161+CD4+ T cells, which contain the precursors of human Th17 cells, did not differentiate into IL-17A-producing cells in response to TGF-b alone. Indeed, TGF-b inhibited Th1 development. These data suggest that TGF-b is not critical for the differentiation of human Th17 cells, but indirectly favours their expansion because Th17 cells are poorly susceptible to its suppressive effects.

18 - APOPTOSIS NELLA RISPOSTA IMMUNE AI TUMORI
Parmiani G., Maccalli C., Rivoltini L.
Unità di Immuno-Bioterapia dei Tumori Solidi,Istituto Scientifico e Universitario Fondazione San Raffaele, Milano e Unità di Immunoterapia dei Tumori Umani, Fondaziione Istituto Nazionale Tumori, Milano

L’apoptosi è un fenomeno di grande importanza nella terapia biologica dei tumori per almeno due ragioni. Infatti da un lato è noto che le cellule tumorali hanno una aumentata resistenza alla apoptosi, soprattutto a quella indotta da diversi farmaci, dall’altro possono provocare esse stesse l’apoptosi di cellule normali che difendono il nostro organismo dal tumore in crescita come i linfociti T. Nel secondo caso l’apoptosi dei linfociti contribuisce alla capacità del tumore di sfuggire alla reazione immunologica. Una molecola coinvolta in questo fenomeno è FasLigando che abbiamo visto essere espressa da cellule tumorali umane come quelle del melanoma e del carcinoma del colon. L’interazione dunque di queste cellule tumorali esprimenti FasL con linfociti T attivati esprimenti Fas può condurre alla morte del linfocita (contrattacco). Tuttavia FasL è rapidamente rilasciato dalle cellule tumorali e si può ritrovare nel sangue dei pazienti in una forma solubile ma probabilmente poco attiva. Noi abbiamo dimostrato con analisi PCR che FasL è però costantemente presente nel citoplasma delle cellule di melanoma. Inoltre la capacità di indurre apoptosi nei linfociti da parte delle cellule di melanoma non si manifesta nei confronti di cloni di linfociti T Fas+ ma pre-stimolati con antigeni melanoma-associati quali MelanA o gp100 suggerendo che cellule già funzionalmente attivate e differenziate in saenso citotossico possano impedire la trasmissione del messaggio apoptotico attraverso Fas/FasL .
Apoptosi indotta nelle cellule tumorali con diversi meccanismi da parte di agenti chemioterapici o radioterapia può promuovere un aumento nel rilascio di antigeni localmente o a livello sistemico e indurre una più forte risposta immunitaria nel confronto del tumore. Dati ottenuti in vitro nel melanoma umano a sostegno di questa ipotesi verranno presentati.

19 - APOPTOSI NEL DIABETE
Davide Lauro
Università degli Studi di Roma “Tor Vergata”

20 - APOPTOSI NELLE PATOLOGIE OFTALMOLOGICHE
Carlo Nucci
Università degli Studi di Roma “Tor Vergata”

21 - APOPTOSI, ATROFIA MUSCOLARE E CACHESSIA
Costelli P.
Dipartimento di Medicina e Oncologia sperimentale, Università di Torino

Diverse patologie croniche quali diabete, tumori, malattie autoimmunitarie e neurodegenerative, sono caratterizzate da marcata perdita di massa muscolare, prevalentemente associata ad aumentati tassi di degradazione proteica. I meccanismi alla base di questa condizione di ipercatabolismo proteico muscolare sono stati chiariti solo in parte. Recentemente è stato proposto che la ridotta trasduzione dei segnali dipendenti da insulina/IGF-1 possa giocare un ruolo importante. Tuttavia, diversi studi clinici e sperimentali hanno suggerito che anche la perdita cellulare possa contribuire alla deplezione muscolare. In particolare, è stato riportato che l’atrofia muscolare che si osserva in patologie degenerative quali distrofie, encefalomiopatie, sclerosi laterale amiotrofica e insufficienza cardiaca cronica possa essere associata a riduzione del numero di mionuclei, probabilmente dovuta ad attivazione dell’apoptosi.
Nell’ambito delle patologie associate ad atrofia muscolare, viene rivolto un particolare interesse alla cachessia neoplastica, una sindrome complessa che si sviluppa frequentemente nei pazienti oncologici, compromettendone la qualità di vita e la tolleranza alle terapie antiblastiche. Alcune osservazioni effettuate su modelli sperimentali suggeriscono che l’apoptosi contribuisca in maniera determinante alla patogenesi della perdita di massa muscolare che si osserva in corso di cachessia. La situazione non è invece altrettanto chiara per quanto riguarda la patologia umana. La letteratura, infatti, riporta sia la presenza che l’assenza di eventi apoptotici nel tessuto muscolare di pazienti neoplastici, rendendo evidente la necessità di approfondire gli studi in questa direzione.
Ringraziamenti: MIUR, Regione Piemonte, Università di Torino, AIRC

22 - APOPTOSI E VIRUS
Mastino A., Sciortino M.T., Medici M.A., Marino-Merlo F.
Dipartimento di Scienze della Vita "M. Malpighi", Università di Messina, Messina

La risposta cellulare apoptotica rappresenta un'importante forma di difesa antivirale di prima linea, in grado di contenere efficientemente la replicazione e la diffusione dei virus. In particolare, questa difesa può essere considerata la più primordiale forma di risposta cellulare degli organismi multicellulari ai virus, risultando comune a tutti i phyla dei metazoi, comprese le piante, che mancano di un sistema immune basato su cellule mobili a funzioni specializzate. Come conseguenza di ciò, la co-evoluzione di ospiti e virus ha determinato la capacità di questi ultimi di esser dotati di una molteplice varietà di strategie di sopravvivenza per sfuggire all'eliminazione mediante apoptosi. D'altro conto, l'altra faccia della medaglia rappresentata dalla morte cellulare apoptotica, è quella che riconosce in essa proprio un meccanismo attraverso cui alcuni virus esercitano la loro azione patogenetica, traendo proprio vantaggio da questa forma di difesa innata. Negli ultimi anni sono stati raccolti numerosissimi dati sugli eventi molecolari coinvolti in quasti fenomeni  Dopo una breve review sullo stato dell'arte delle relazioni tra apoptosi e virus ed averne discusso gli aspetti generali, verranno presentati, a titolo esemplificativo, alcuni dei risultati delle ricerche, eseguite presso il laboratorio di cui il relatore è responsabile durante l'ultima decade, sulle relazioni tra virus herpes simplex (HSV) ed apoptosi. Tali virus sembrano infatti in grado di esercitare un fine controllo sull'apoptosi delle cellule infettate, di tipo positivo o negativo, a seconda della presenza od assenza di specifici geni virali, condizioni sperimentali o specificità del target cellulare.
Ringraziamenti: Ricerche eseguite nell'ambito di Progetti PRIN finanziati dal MIUR

23 - AMPK INHIBITION INDUCES APOPTOSIS IN PEDIATRIC B-ALL CELLS WITH MLL GENE REARRANGEMENTS
Accordi B.1, Espina V.2, Giordan M.1, VanMeter A.J.2, Galla L.1, Milani G.1, Sciro M.1, De Maria R.3, te Kronnie G.1, Petricoin E.F.2, Liotta L.A.2, Basso G.1
1Oncohematology Laboratory, Department of Pediatrics, University of Padova, Italy, 2Center for Applied Proteomics and Molecular Medicine, George Mason University, VA, USA., 3Department of Hematology, Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, Italy

INTRODUCTION
Remarkable progress has been made in the past decade in pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) treatment, reaching cure rates of about 80%, but therapy is not yet effective in all cases. Infants with MLL gene rearrangements form the most striking example of patients who have not benefited from the improved treatment regimens. Consequently, current interest focuses on identifying new specific molecular targets to find new patient-tailored therapies. Thus, to identify aberrantly activated signal transduction pathways in MLL-rearranged patients, we used Reverse Phase Protein Microarrays (RPMA). We further investigate RPMA results with in vitro studies testing the effects of a specific kinase inhibitor on apoptosis induction in leukemia cell lines.

METHODS
We compared with RPMA the signal transduction pathways working state of 8 MLL-rearranged patients vs 41 without known genomic translocations ones. Phosphorylation status of 92 signalling proteins was analyzed. Based on RPMA results, we tested through proliferation and apoptosis assays the effect of Compound C, a specific AMPK inhibitor, on selected B-ALL human cell lines: 2 MLL-rearranged (SEM and RS4;11) and 2 non-translocated (MHH-CALL-2 and MHH-CALL-4). To characterize the mechanism of Compound C-induced apoptosis we are performing cell cycle and other apoptotic markers analyses (Western Blot and flow cytometry).

RESULTS
MLL-rearranged patients show an hyperactivated pathway that, through AMPK phosphorylation, leads to BCL-2 activation. Selected cell lines respond very differently to AMPK inhibition. GI50 (Growth Inhibition) at 48h is 0.2µM for SEM, 3µM for RS4;11, and 26µM for non-translocated cell lines. LC50 (Lethal Concentration) at 48h is 7.5µM for SEM, 8.5µM for RS4;11 and 38µM for non-translocated cell lines. Cell cycle analyses performed at GI50 reveal an arrest at G2/M phase. Additional experiments to better describe Compound C-induced apoptosis are in progress.

CONCLUSIONS
Our results thus demonstrate that the AMPK pathway is hyperactivated in MLL-rearranged patients, and it appears to directly contribute to the survival of MLL-rearranged cells. This study emphasizes the importance of protein pathway analysis as a route for discovery of functional derangement that may be functional, causative agents of cancer. Our data suggest AMPK as a new molecular target and encourage further studies of AMPK inhibitors as potential new drugs for treatment of MLL rearranged leukemia patients.

Ringraziamenti
This work was supported by grants from the Istituto Superiore di Sanità, the Fondazione Città della Speranza, the Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, the PRIN MIUR, and the GMU College of Science

24 - RUOLO DELLE CELLULE NATURAL KILLER (NK) NELLA FISIOPATOLOGIA DELL’INFEZIONE DA HIV-1
Mavilio D.
IRCCS, Istituto Clinico Humanitas, Via A. Manzoni 113, Rozzano, Milano, Italia

Lo studio della fisiopatologia della risposta immunitaria contro patogeni virali rappresenta ancora una delle sfide più importanti della moderna ricerca biomedica. La mancanza di terapie risolutive ed il fallimento di diversi trial vaccinici contro HIV-1 sono una diretta conseguenza dei troppi punti interrogativi ancora legati alla patogenesi dell’infezione. La nostra ricerca ha contribuito ad evidenziare le principali disfunzioni dell’immunità innata che permettono al virus HIV-1 di aggirare facilmente la risposta immunologica. In particolare abbiamo dimostrato che alti livelli di viremia inducono la comparsa di sottopopolazioni cellulari NK patologiche, raramente presenti in soggetti normali. Questi subset di cellule aberranti sono caratterizzati da attività citolitiche ed antivirali molto basse, se non addirittura  assenti. Tale anergia compromette in modo rilevante la fisiologica capacità delle cellule NK di effettuare immuno-sorveglianza contro tutti i tumori e le infezioni. Inoltre, le anomalie fenotipiche e funzionali delle cellule NK patologiche alterano anche le interazioni tra cellule NK e Cellule Dendritiche: queste alterazioni impediscono il corretto sviluppo di una risposta antigene specifica contro il virus HIV-1 ed, al contrario, favoriscono il propagarsi dell’infezione stessa nei tessuti linfoidi. Infine, l’identificazione di sottopolazioni cellulari NK patologiche riflette anche gli stadi clinici dell’infezione e la corretta risposta alla terapia antiretrovirale. In tal senso, la caratterizzazione fenotipica di alcune molecole espresse sulle cellule NK in pazienti HIV-1 potrebbe essere proposta come un nuovo marcatore di malattia. Nel prossimo futuro ci proponiamo di trasferire le nostre scoperte sperimentali sia nella pratica clinica giornaliera (uso delle cellule NK come marcatori di malattia) sia nello sviluppo di strategie terapeutiche alternative.
Ringraziamenti - A tutti i pazienti HIV-1 infetti che hanno generosamente e coraggiosamente contribuito a fare in modo che questa ricerca fosse possible. A tutti coloro che hanno partecipato a questo progetto.

25 - ROLE OF ENDOPLASMIC RETICULUM (ER) STRESS IN APOPTOSIS INDUCED BY LIPOIC ACID
Camboni T., Pibiri M., Leoni V.P., Columbano A., Ledda-Columbano G.M., Simbula G.
Department of Toxicology, University of Cagliari, Cagliari, Italy

Introduction The term “endoplasmic reticulum stress” defines any perturbation that compromises the protein folding functionality of the ER. ER stress leads to a cell stress response, the Unfolded Protein Response (UPR), which is aimed initially at compensating for damage but can eventually trigger apoptosis if ER dysfunction is prolonged. The activation of protective mechanisms against consequences of ER malfunction are recognized as key concepts in cancer cell biology. Although cell stress response represents homeostatic mechanism allowing cells to survive in presence of the altered functions of the ER, it is not clear how these mechanism interact with signalling pathways controlling apoptosis. Understanding the links between ER stress and apoptosis may be approached using drugs able to induce ER stress responses in cancer cells. α-lipoic acid (LA), a natural antioxidant, was suggested to be a potential cancer preventive agent since it induces apoptosis of some cancer cell types. Aim Recently, we have shown that LA induces apoptosis in hepatoma cells which is preceded by alteration in redox state. Since alteration in redox state has often been implicated in ER stress induction, the aim of this study was to determine whether LA induces ER stress in hepatoma cells, Fao, and eventually to elucidate the role of ER stress responses in LA-induced apoptosis. Materials and Methods Cell viability was determined by NRU assay. Protein expression was determined by Western blot. RT-PCR was performed to analyze XBP1 mRNA splicing. Results Treatment of Fao cells with LA causes a progressive increase in the expression of a well known marker of ER stress, GRP78. Furthermore, apoptosis LA-induced is associated to the activation of two parallel pathways related to UPR and involved in apoptosis, named IRE/XBP1 and PERK/CHOP. Discussion These findings demonstrate that ER stress plays a crucial role in LA-induced apoptosis of hepatoma cells. Further investigations will be required to elucidate the spectrum of pathophysiological significance of the induction of the ER stress in tumor cells in order to facilitate a more selective tumor-cell targeting than that achieved by conventional therapy.

26 - CPTH6 IS A NOVEL INHIBITOR OF HISTONE ACETYLTRANSFERASES IN CANCER CELLS
Del Bufalo D.
Laboratorio Chemioterapia Sperimentale Preclinica, Istituto Regina Elena, Roma

Chromatin structure, and thereby transcription, is controlled by the level of histones acetylation, which is determined by a balance between histone acetyl transferase (HATs) and histone deacetylase (HDACs) activities. Hence, the post-translational modification of proteins by HATs or HDACs plays an important role in the control of gene expression, and its deregulation has been linked to malignant transformation and other diseases. Although histone deacetylases inhibitors have been extensively studied and several of them are currently in clinical trials, there is little information available on inhibitors of HATs. Here, we present the biological properties of a cyclopentylidene-4[4-(4’-chlorophenyl)thiazol-2-yl]hydrazone (CPTH6), previously discovered as inhibitor of HAT activity through a phenotypic screening in yeast. CPTH-6 was selected, between 4 different synthesized thiazole compounds, based on its strong inhibitory effect on the growth of several human tumor cell lines. We demonstrated that CPTH6 inhibits cell growth of leukemia cell lines, decreases total acetylation of histones H3 in a time-dependent manner, and counteracts the acetylating action of the HDAC inhibitor Trichostatin A. A perturbation of cell cycle distribution (G1 phase arrest and concomitant S phase depletion) and an induction of apoptosis were also observed after treatment with CPTH6. In conclusion, our study suggests that CPTH6 could be a promising agent for anticancer therapy.

27 - INVECCHIAMENTO, SENESCENZA E APOPTOSI NELLA TERAPIA ANTIANGIOGENICA
Albini A.
Gruppo Multimedica, IRCCS, Milano

Endothelial cell senescence and apoptosis is a feature of numerous pathologies, including atherosclerosis, allograft vasculopathy, heart failure, diabetic retinopathy and scleroderma. In contrast, endothelial activation and replication associated with vessel proliferation and angiogenesis is now a therapeutic target in other diseases such as cancer and macular dystrophy. Preventive medical approaches, in particular cardiovascular and cancer chemoprevention, commonly target the endothelium, a concept we termed angioprevention.  There is an intricate interplay between endothelial cell senescence and apoptosis during angioprevention, anti-angiogenic therapy and standard cancer chemotherapy.  Microarray data on senescent endothelial cells or endothelial cells treated with angiopreentive compounds in vitro shows many genes that are similarly modulated in both conditions.  Our data indicate that effective drugs may induce endothelial senescence.  However, drug targeting remains a key issue, we have examined the potential of nanoparticles, and in particular single walled nanotubes (SWCNTs), as potential vehicles for anti-angiogenic drugs.  SWCNTs when injected intravenously in vivo appear to be tolerated; Raman spectra analyses of tissues suggested accumulation within the liver and spleen, indicating capture by the reticuloendothelial cell system (RES).  We then Tested the effects of these structures on endothelial cells in vitro.  SWCNTs did not cause significant apoptosis or necrosis, although activation of autophagy pathways were observed in electron microscpopy.  Our data indicate that SWCNTs transiently accumulate in the lysosomal apparatus of endothelial cells.  The SWCNTs appear to collect around the cells and penetrate into cellular structures, creating local stress.

28 - APOPTOSIS AND SURVIVAL IN ONCOLOGY
Nicolin A.
Dipartimento di Farmacologia, Chemioterapia e Tossicologia Medica- Università degli Studi di Milano – Via Vanvitelli 32, 20129 Milano

AKT kinase mediates signalling pathways downstream of activated tyrosine kinases and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). The PI3K/AKT pathway can be activated by a variety of extracellular signals and regulates diverse cellular processes including cell proliferation and survival, cell size and response to nutrient availability, tissue invasion and angiogenesis. PI3K transmits the mitogenic signals through AKT to the mammalian target of rapamycin (mTOR). mTOR is a serine/threonine kinase which controls protein synthesis, cell cycle progression, cell proliferation, and tumor growth. We have recently shown a role of mTOR in the regulation of apoptosis induced by microtubule-damaging agents, such as taxol and nocodazole. We investigated whether AKT, the upstream activator of mTOR in survival signalling, might regulate the death signals triggered by anti-microtubule drugs. We found that genetically modified AKT regulates Bcl-2 phosphorylation and cell death induced by taxol and nocodazole. These effects, inhibited by rapamycin, indicate that the PI3K/AKT/mTOR pathway can regulate both survival and death signals simultaneously. Our findings support a switch role for mTOR in regulating life or death signals: the down-regulation of the AKT/mTOR survival pathway strengthens the death signals induced by microtubule damage, whereas the up-regulation of the survival signalling converging on mTOR inhibits the microtubule-related apoptotic program. According to our model, we demonstrated that the synergy between inhibition of growth factor pathway and stimulation of microtubule-dependent apoptotic pathway—both of them converging on mTOR— can promote a decrease of Bcl-2 level, enhancing the tumor cell sensitivity to apoptosis induced by anticancer agents. Recent studies show that down-regulation of AKT can lower the apoptotic threshold and render cancer cells sensitive to the drug treatment. We explored this possibility in a panel of prostate cancer cells where mutations of the phosphatase PTEN activate the kinase cascade PI3K/AKT/mTOR. Silencing AKT efficiently sensitized cells to anti-microtubule agents in PTEN-mutated cells. This study showed that in prostate tumor cells in which the survival pathway is up-regulated by the mutated PTEN, down-regulation of AKT kinase can reactivate the apoptotic pathway and the drug responsiveness as well. Overall our findings have relevance for cancer therapy as they indicate the molecular mechanisms by which inhibition of the survival cascade upstream of mTOR can potentiate the death cascade.
Ringraziamenti: We thank Drs Susan W Y Chen and Peter R. Shepherd (University College London, London, United Kingdom) for the α-P-mTOR antibodies and Dr Alberto Gulino for Akt plasmids. This work was supported by grants from MIUR and Istituto Superiore di Sanità.

29 - STRATEGIE FARMACOLOGICHE PER IL SUPERAMENTO DELLA CHEMIORESISTENZA TUMORALE
Mini E.
Università degli Studi di Firenze

30 - CARBONIC ANHYDRASE INHIBITION FOR DESIGNING ANTITUMOR AGENTS AND DIAGNOSTIC TOOLS
Supuran C.T.
Laboratorio di Chimica Bioinorganica, Università degli Studi di Firenze, Rm 188, Via della Lastruccia 3, I-50019 Sesto Fiorentino, Firenze, Italy. claudiu.supuran@unifi.it

Carbonic anhydrases (CAs), a group of ubiquitously expressed metalloenzymes, are involved in numerous physiological and pathological processes, including gluconeogenesis, lipogenesis, ureagenesis, tumorigenicity and the growth and virulence of various pathogens. In addition to the established role of CA inhibitors (CAIs) as diuretics and antiglaucoma drugs, it has recently emerged that CAIs could have potential as novel anti-obesity, anticancer and anti-infective drugs. Furthermore, recent studies suggest that CA activation may provide a novel therapy for Alzheimer's disease. This contribution discusses the biological rationale for the novel uses of inhibitors or activators of CA activity in multiple diseases, mainly cancer, and highlights progress in the development of specific modulators of the relevant CA isoforms, some of which are now being evaluated in clinical trials (1).

(1) Supuran, C.T. Nature Rev. Drug Discov. 2008, 7, 168-181.

31 - APOPTOSI O AUTOFAGIA NELLA REGRESSIONE DEI TUMORI STROMALI GASTROINTESTINALI TRATTATI CON IMATINIB?
Negri T.
Laboratorio di Patologia Molecolare Sperimentale, Dipartimento di Anatomia Patologica, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milano

Introduzione
I Tumori Stromali Gastrointestinali (GIST), caratterizzati spesso da mutazioni attivanti nel gene c-kit, vengono trattati con successo con Imatinib, inibitore di recettori tirosin-chinasici quali KIT e PDGFRA. Il grado di regressione tumorale dovuta al farmaco viene valutata sui pezzi operatori dei pazienti trattati, che vengono analizzati morfologicamente e definiti in risposta più o meno marcata. Nonostante sia riportato in letteratura che Imatinib provochi apoptosi in linee cellulari di GIST, l’analisi morfologica di tali pezzi operatori suggerisce che il farmaco causi autofagia e non apoptosi.

Scopi
Chiarire se la regressione tumorale che caratterizza i pezzi operatori in risposta ad Imatinib sia dovuta ad autofagia o ad apoptosi.

Metodi
Campioni di pezzi operatori di 11 pazienti affetti da GIST e trattati con Imatinib e di 2 pazienti non trattati, utilizzati come controllo, sono stati analizzati mediante biochimica (immunoprecipitazione/Western blotting) ed immunoistochimica, avendo a disposizione sia materiale congelato che fissato in formalina ed incluso in paraffina. La regressione patologica dei campioni dopo trattamento con Imatinib è stata valutata come indice di risposta al trattamento.

Risultati
L’espressione di proteine correlate all’autofagia (beclina 1, PI3KIII, LC3-II) e la loro interazione (complesso beclina 1/PI3KIII) sono state dimostrate nei campioni di GIST analizzati, a differenza dei marcatori dell’apoptosi (caspasi e lamina A/C clivate) che non sono risultati espressi.

Conclusioni
I risultati ottenuti suggeriscono che l’autofagia caratterizza i GIST ed il loro trattamento con Imatinib induce autofagia e non apoptosi.

Ringraziamenti: Francesca Miselli, Alessandro Gronchi, Marco Losa, Elena Conca, Silvia Brich, Elena Fumagalli, Marco Fiore, Paolo G. Casali, Marco A. Pierotti, Elena Tamborini, Silvana Pilotti.

32 - LE PROPRIETÀ ONCOSOPPRESSIVE INTRINSECHE DELL’ONCOGENE MET COME STRUMENTO DI MORTE APOPTOTICA DELLE CELLULE TUMORALI
Di Renzo M.F.
Università degli Studi di Torino - IRCC,Candiolo, Torino

Intrinsic tumor suppression pathways are innate and self defeating programmes that evolution has associated to oncogenes to balance the threatening ones. Intrinsic tumor suppressor activity of the RAS and MYC oncogenes has been widely demonstrated. It has been also sought as a switch useful to turn oncogenic signals into cytotoxic or cytostatic ones. Oncogenic tyrosine kinases (TKs) might harbor intrinsic tumor suppressive functions. They sit at the apex of multiple downstream signaling pathways that exert various biological effects depending upon cell type and context. While some of these pathways are mitogenic and pro-survival, others might restrain the oncogenic potential by promoting, for example, apoptosis and senescence. Obviously, the latter programmes do not confer a selective advantage to neoplastic cells and thus they are hidden in cancer cells. However it is conceivable that intrinsic tumor suppression of TKs might be unleashed by either oncogene inhibition or, paradoxically, by oncogenic activation.
We have demonstrated that, in the context of ovarian cancer cells, HGF dependent activation of the MET oncogene results in activation of a cell death programme, which is revealed by the subsequent cell treatment with drugs, and that this program fully relies of p38MAPK activation. This was a novel and surprising finding. HGF elicits a distinctive biological program known as ‘‘invasive growth’’ by orchestrating cell survival, proliferation, and motility through activation of its receptor and of several downstream signaling pathways, such as the extracellular signal-regulated kinase 1/2 mitogen-activated protein kinases (MAPK) and phosphatidylinositol 3- kinase/AKT and the AKT substrate mammalian target of rapamycin. We found, indeed, that the above pathways are activated by HGF in ovarian cancer cells, but they are overcome by the pro-apoptotic activation of p38MAPK. We also demonstrated that this mechanism operates in an array of ovarian cancer cell lines, carrying different genetic abnormalities, such as either PI3K mutation or amplification or AKT amplification and either p53 proficiency or deletion.
As we have shown that in ovarian cancer cell lines HGF dependent sensitization to drugs requires long-term exposure, we hypothesized that HGF pro-apoptotic effect could be coupled to transcriptional regulation of gene transcription and we have studied the transcriptional targets of HGF and cisplatin, alone or in combination, in ovarian cancer cell lines. The identified molecules are sought as regulators of ovarian cancer cell apoptotic death and can be prospectively viewed as targets for therapy. We have identified transcripts modulated in cells committed to death by HGF. Among them, we found L2DTL/CDT2/RAMP, a subunit of the RING-CUL4 complex that confers specificity to the above ubiquitin ligase for the CDT1 (replication licensing factor) and for p21. We also show that silencing of CDT2 impairs survival not only of ovarian cancer but also of other cancer cell lines but not of immortalized normal human cells lines.
Ringraziamenti: this work is funded by AIRC (the Italian Association for Cancer Research) and by the Italian Ministry of Health.

33 - IL PARTENOLIDE SENSIBILIZZA LE CELLULE DI EPATOCARCINOMA ALL’APOPTOSI INDOTTA DA TRAIL
Carlisi D., Emanuele S., Angileri L., D’Anneo A., Ciraolo A., Montalbano R., Vento R. e Tesoriere G.
Dipartimento di Scienze Biochimiche, Università degli Studi di Palermo, Policlinico via del Vespro 129, 90127 Palermo

Introduzione
TRAIL è un membro della superfamiglia “TNF”, in grado di indurre morte per apoptosi in cellule tumorali, risultando poco tossico per le cellule normali. Tuttavia, alcune forme tumorali, come il carcinoma epatocellulare, mostrano resistenza all’apoptosi indotta da TRAIL, che può essere prevenuto associando al TRAIL altri composti quali gli inibitori del proteasoma o delle deacetilasi istoniche.
Il partenolide, un sesquiterpene lattone derivato dalla pianta medicinale "Tanacetum partenium", è noto per le sue proprietà antiinfiammatorie correlate con l’inibizione di NF-kB. Il partenolide riduce anche la fosforilazione di STAT-3, inibendo così il segnale trasdotto da citochine della famiglia della IL-6. Recentemente è emerso che il partenolide esercita un’azione antiproliferativa e pro-apoptotica in diverse linee tumorali ed inoltre, annulla la resistenza a TRAIL in cellule di cancro alla mammella e mieloma multiplo.

Obiettivo
Questo studio intende accertare se il partenolide è in grado di sensibilizzare le cellule di epatocarcinoma umano all’apoptosi indotta da TRAIL.

Materiali e Metodi
Linee di epatocarcinoma cellulare impiegate: HepG2, Hep3B e SK-Hep1. Composti utilizzati: partenolide (25 mM) e TRAIL ricombinante umano (50 ng/ml). L’apoptosi è stata valutata mediante analisi citofluorimetrica dopo colorazione con annessinaV/PI. Sono stati condotti esperimenti di western blotting, real-time PCR, trasfezione con siRNA per STAT3.

Risultati e discussione
I nostri studi evidenziano che dosi sub-tossiche di partenolide sensibilizzano le cellule di epatocarcinoma HepG2, Hep3B e SK-Hep1 all’apoptosi indotta da TRAIL e che partenolide e TRAIL interegiscono con meccanismo sinergico. Inoltre, in tutte e tre le linee cellulari l’evento apoptotico, indotto dalla combinazione partenolide/TRAIL, si accompagna ad un notevole aumento dell’espressione dei recettori di morte DR4 e DR5. Questi effetti possono essere correlati con variazioni delle proteine STAT. Infatti, sia il partenolide che l’associazione partenolide-TRAIL riducono i livelli delle forme fosforilate attive di STAT3 e STAT5. Inoltre, il silenziamento di STAT3 potenzia l’effetto del partenolide sui recettori di morte, suggerendo, quindi, che STAT3 può inibire trascrizionalmente DR4 e DR5.
Infine, il trattamento col solo partenolide aumenta i livelli di p53, effetto che potrebbe contribuire all’up-regulation dei recettori di morte.
I risultati indicano che il trattamento combinato partenolide/TRAIL induce una rapida attivazione della caspasi-8, seguita dall’attivazione della caspasi-3. Nel meccanismo apoptotico non sembra essere coinvolto il mitocondrio.
L’impiego del partenolide nel sensibilizzare cellule di epatocarcinoma all’apoptosi indotta da TRAIL potrebbe rappresentare una valida strategia terapeutica nel trattamento dei tumori epatici.

34 - IN VITRO AND IN VIVO FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF NEW CYCLE-PEPTIDES INHIBITORS FOR C-X-C CHEMOKINE RECEPTOR-4 (CXCR4)
Portella L.1, Napolitano M.1, Consales C.1, D’Alterio C.1, Polimero M.1, Cioffi M.1, Vitale R.M.3,2, Monfregola L. 2, Castello G.1 and Scala S.1
1U.O.S.C. Immunologia Oncologica ,Istituto Nazionale Tumori Fondazione “G. Pascale” Napoli (Italy). – dott.portella@gmail.com
2Istituto di Biostrutture e Bioimmagini (IBB)- CNR. Napoli (Italy)
3Istituto di Chimica Biomolecolare del CNR. Comprensorio "A. Olivetti", Pozzuoli (Napoli) – Italy

The C-X-C chemokine receptor-4 (CXCR4) is a receptor for stromal cell-derived factor 1a (SDF-1a/CXCL12) mainly  implicated in lymphocytes homing. CXCR4 is also overexpressed in human cancers while SDF-1a is preferentially expressed in organs sites of metastasis. Thus, efficient CXCR4 antagonists could are welcome to inhibit metastatic spreading. Through rationale design a new library (20 units) of cycle-peptide molecules, that consists of  5 and 7 amino-acid residues cycled by a S-S bridge, was generated based on SDF-1a and v-MIP II analogy. CCRF-CEM ,T-leukemia cell lines and PES43, human melanoma cell line, overexpressing CXCR4 were evaluated for the capability of CXCR4 inhibition through the above peptides. Indirect receptor binding and calcium flux were evaluated by flow cytometry, ERK1 and ERK2 phosphorylation, and cell migration were evaluated too. Four cycle-peptides showed a significant inhibitory activity on chemokine-induced receptor’s activation. Supported by in vitro results we move to in vivo experiments. Treatment of CXCR4-B16 transduced mice showed inhibition of lung metastases in  mice treated with 3 out of 4 peptides as compared to AMD3100. Ongoing experiments are evaluating the tumor growth inhinition by peptides' treatment in xenograft mice s.c. injected with SN12C-pEGFP cells (Human Renal Cell Carcinoma). Thus according to our results cycled peptides CXCR4 inhibitors could play an important role as therapeutic agents against cancer progression.

35 - NANOPARTICELLE DI ZNO INDUCONO STRESS OSSIDATIVO E APOPTOSI IN CELLULE DI CARCINOMA DEL COLON (LOVO)
B. De Berardis, G. Civitelli, M. Condello, P. Lista, R. Pozzi, G. Arancia, S. Meschini
Dip. Tecnologie e Salute, Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena 299, 00161 Roma

Introduzione
Le nanoparticelle (NP) vengono attualmente utilizzate in numerose applicazioni industriali e biomediche. Nonostante ciò, non sono stati ancora completamente chiariti i loro possibili effetti negativi sull'utilizzatore finale, sul lavoratore impiegato nella produzione e sull'ambiente. La valutazione del rischio relativo all’impiego delle NP è ostacolata dalla mancanza di standard di riferimento per valutarne la citotossicità. Poiché le NP possono essere assunte anche per ingestione e quindi provocare danni all’epitelio intestinale, in questo studio abbiamo valutato gli eventuali effetti citotossici delle nanoparticelle di ossido di zinco (ZnO-NP) su una linea cellulare umana di carcinoma del colon (LoVo).
Metodi
Le colture cellulari sono state trattate con concentrazioni crescenti di ZnO-NP e sono state ricavate le curve di crescita per verificarne l'effetto sulla proliferazione cellulare. Le cellule trattate sono state analizzate mediante microscopia ottica e microscopia elettronica a scansione per rivelare eventuali alterazioni morfologico-ultrastrutturali. La citotossicità è stata valutata mediante il test colorimetrico WST-1 (water-soluble tetrazolium assay). La produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), i livelli di glutatione, le modificazioni del potenziale di membrana mitocondriale e l’espressione dei marker apoptotici sono stati quantificati mediante citometria a flusso.
Risultati e discussione
Le preparazioni di ZnO-NP sono state dapprima caratterizzate per le loro proprietà chimico fisiche e morfologiche utilizzando la microscopia elettronica a scansione e a trasmissione. Le sospensioni di particelle usate per trattare le colture cellulari contenevano essenzialmente singole particelle sferiche di natura cristallina (45-60 nm) ed aggregati di varie dimensioni (100-600 nm). Il trattamento delle cellule LoVo con le ZnO-NP (5μg/cm² per 24 ore) induceva una notevole diminuzione della vitalità cellulare, un aumento della produzione di H2O2/OH., una diminuzione della produzione di O2-. e contenuto di glutatione, depolarizzazione delle membrane mitocondriali. Tali alterazioni apparivano essere dose- e tempo-dipendenti. Le analisi microscopiche (Hoechst staining) e citofluorimetriche (Annexin V-FITC and propidium iodide double staining) hanno chiaramente indicato l’induzione del processo apoptotico nelle cellule LoVo in seguito all’interazione con le ZnO-NP.
In conclusione, i risultati di questo studio sembrano dimostrare che le nanoparticelle di ZnO sono fortemente citotossiche per le cellule LoVo inducendo stress ossidativo con conseguente morte cellulare per apoptosi.

36 - DEGRADATION OF P73 BY TWO NOVEL E3 UBIQUITIN LIGASES
Melino G.
University Tor Vergata, Rome, Italy; Medical Research Council, Toxicology Unit, Leicester, UK

p73 steady state protein levels are kept low under normal physiological conditions through degradation by the 26S proteasome, mediated by the HECT-containing E3 ubiquitin ligase Itch. In addition to this major degradation pathway, we described two novel mechanisms of degradation. Firstly, we identified that the orphan F-box protein FBXO45, can target both TAp73 and ΔNp73 isoforms to degradation by poly-ubiquitylation. Moreover, silencing of FBXO45 in human tumour cell lines resulted in p73 stabilization preceded by cell death in a p53-independent manner. FBXO45 is the human ortholog of the C.elegans F-box protein FSN-1, therefore this novel finding elucidates a conserved pathway evolved from nematode to human, by which the p53 family members are regulated by an SCF-dependent mechanism. Secondly, we identified and characterized a novel transcriptional target of TAp73 the ring finger domain ubiquitin ligase PIR (p73-induced Ring Finger). Although DNA damaging agents induced PIR expression, its overexpression had no significant direct consequence per se on apoptotic response or cell cycle profile. However, co-expression of PIR with TAp73 or ΔNp73 resulted in the preferential degradation of ΔNp73, hence an increase in the TA/ΔNp73 ratio. Finally, PIR was able to relieve the inhibitory effect of ΔNp73 on TAp73 induced apoptosis following DNA damage. PIR seems to be the first ubiquitin ligase able to differentiate between the TAp73 and ΔNp73 isoforms. Indeed, in response to DNA damage TAp73 is activated to induce cell cycle arrest or apoptosis, while ΔNp73 is rapidly degraded, highlighting the significance of the relative ratio of each isoform. This differential regulation of TAp73/ΔNp73 stability may offer a novel therapeutic approach to enhance the chemosensitivity of tumour cells. In conclusion, we describe two novel mechanisms of p73 degradation, by FBXO45 and by PIR.

37 - INGEGNERIA DEI TESSUTI: UNA NUOVA PROSPETTIVA PER LA RIPARAZIONE DEGLI ORGANI?
Di Nardo P.
Lab. di Cardiologia Molecolare e. Cellulare, Università di Roma Tor Vergata
Japanese-Italian Tissue Engineering Laboratory, TWIns, Tokyo

La rigenerazione del tessuto miocardico e’ considerata una straordinaria sfida dalla comunità scientifica internazionale, data la complessità di tale tessuto e l’impatto delle patologie cardiache sul benessere della popolazione. Recentemente, l’utilizzo di cellule staminali adulte di derivazione autologa ha suscitato grande interesse, ma i primi tentativi di iniettare cellule progenitrici nel miocardio hanno dato esito incerto. Per questo motivo, approcci terapeutici basati sull’utilizzo di cellule staminali adulte in combinazione con strutture polimeriche biocompatibili appaiono particolarmente promettenti nel trattamento delle patologie cardiache. Esperimenti recenti realizzati dal nostro gruppo hanno indicato che l’adozione di particolari accorgimenti nel disegno degli scaffold polimerici permette non soltanto la corretta adesione delle cellule staminali adulte, ma puo’ influenzarne la proliferazione, la vitalità e persino la capacità differenziativa. Per tale motivo, cellule staminali adulte di origine midollare, cardiaca e adipose umane e murine sono state coltivate e indotte al differenziamento su scaffold polimerici sintetici (PLA, PLGA, PCL) la cui struttura tridimensionale e la porosità è stata accuratamente studiata. Infine, un innovativo protocollo per generare foglietti multistratificati di cellule staminali in assenza di scaffold e’ stata implementata e testata in vitro ed in vivo, in modelli murini di infarto del miocardio.

38 - BIOMATERIALI IN MEDICINA RIGENERATIVA: INFLUENZA SULL’APOPTOSI
Barbucci R.
Università degli Studi di Siena

39 - ANALISI DEI RISCHI DEL PROCESSO DI PRODUZIONE DI MEDICINALI PER TERAPIA CELLULARE SOMATICA IN UNA STRUTTURA OSPEDALIERA IN ACCORDO CON LE GOOD MANIFACTURING PRACTICE
Bambi F.*, Ceccantini R.*, Giannini P.*, Bisin S.*, Gianassi S.°
*Laboratorio di Terapia Cellulare, Servizio Trasfusionale, Dipartimento di Oncoematologia e Terapie domiciliari °Qualità ed accreditamento – Azienda Ospedaliero Universitaria Meyer

Background
I prodotti per terapia cellulare somatica (PTC) sono a tutti gli effetti “farmaci” innovativi sperimentali che costituiscono importanti alternative terapeutiche nell’ambito della medicina rigenerativa, nel trapianto emopoietico per favorire l’attecchimento e controllare la Graft vs Host Desease (GvHD). Appartengono alla classe dei medicinali per terapie avanzate(ATMP) e consistono in  preparazioni a base di cellule vive o parti complesse di esse manipolate in vitro per alterarne alcune caratteristiche biologiche e somministrate a scopo terapeutico ad uso omologo o non omologo. Diversamente dai farmaci convenzionali i PTC sono prodotti in ambiente ospedaliero o in Cell Factory private che devono essere allestite come vere e proprie “officine farmaceutiche” , rispettare l’iter di sviluppo e autorizzativo dei farmaci convenzionali, nonché i requisiti di qualità previsti dalle Good Manufacturing Practice (GMP) per la produzione di farmaci sterili. Le GMP stabiliscono che il contenimento della contaminazione ambientale, la convalida dei sistemi critici e lo sviluppo di un sistema di analisi e gestione del rischio (Quality Risk Management) sono principi irrinunciabili per la produzione di farmaci sterili, ovviamente non sterilizzabili, caratterizzati da una inevitabile variabilità biologica e da una farmacocinetica e farmacodinamica non facilmente standardizzabile.

Scopo e obiettivi
Presso il Laboratorio di Terapie Cellulari del Servizio Trasfusionale dell’Azienda Ospedaliero Universitaria Meyer è stato realizzato un processo di analisi dei rischi per individuare e pesare le criticità della produzione di “farmaci” per terapia cellulare somatica, concorrendo alla definizione di un Validation Master Plan, sviluppando gli opportuni protocolli di convalida di impianti, attrezzature critiche, processi produttivi e sistemi di controllo qualità.

Materiali e Metodi
E’ stata applicata la tecnica HACCP (Hazards Analysis and Critical Control Points) al processo di produzione di cellule mesenchimali midollari (MSC). Sono stati calcolati gli Indici di Priorità di Rischio (IPR) dei pericoli, dei punti di controllo critici (CCP) e dei parametri critici in base alla severità dell’effetto del pericolo sul prodotto e sul paziente e alla frequenza e rilevabilità del parametro che può determinarlo. L’integrazione dei risultati dell’analisi dei rischi con i requisiti GMP è utilizzata per la definizione delle priorità di convalida dei sistemi critici e per la progettazione dei protocolli di qualifica e convalida dei sistemi a maggiore criticità.

Risultati
Sono state individuate 49 attività di processo critiche che potrebbero avere effetti negativi sul prodotto e sul paziente. 31 di queste (105 ≥ IPR ≥ 40) costituiscono un rischio per la safety microbiologica del prodotto; 17 per la vitalità cellulare (64 ≥ IPR ≥ 16) e 15 per l’identità morfologica e fenotipica (48 ≥ IPR ≥ 6). Il rischio di contaminazione è diffuso lungo tutto il processo produttivo, mentre il rischio per l’identità si concentra nella fase di isolamento delle (MSC) dalle altre componenti cellulari del midollo e quello per la vitalità al termine del processo, nella fase di congelamento. Per minimizzare il rischio di contaminazione microbiologica sono state individuate azioni correttive mirate e aggiuntive rispetto ai sistemi di monitoraggio già in essere che hanno impatto sia sull’ambiente che sulle attrezzature che sul personale.
Inoltre sono stati pianificati una serie di test di controllo di qualità sul prodotto intermedio (sterilità, conta cellulare, colorazione sopravitale e immunofenotipo) che vanno ad integrare i test di rilascio obbligatori. Il Validation Master Plan redatto sulla base dei risultati dell’analisi dei rischi attribuisce priorità di convalida alle attrezzature del laboratorio controllo Qualità e successivamente alle tecniche analitiche utilizzate. Poiché il rischio di contaminazione in un simile contesto è di particolare rilievo, è stato progettato e realizzato il protocollo di convalida del Test Rapido di Sterilità (EU-PH 2.6.27) con il sistema automatizzato BacT/ALERT 3D che, avendo un tempo di incubazione di 7 giorni, permette la riduzione del periodo di quarantena del prodotto cellulare, il suo rilascio in deroga e l’attuazione di tempestive azioni correttive in caso di test positivo durante la lavorazione. I risultati di sensibilità, specificità e riproducibilità dei test effettuati sono stati congruenti tra loro e con gli standard di performance indicati dalla ditta produttrice. Il tempo medio di incubazione per la rilevazione di positività è stato di 24 ore per i microrganismi aerobi; di 56 ore per la prova di sensibilità, specificità e riproducibilità e 28 ore per la prova di fertilità per i microrganismi anaerobi, mentre per i miceti è stato necessario di un periodo di incubazione maggiore (48 ore per la prova di sensibilità, specificità e riproducibilità e 44 ore per la prova di fertilità).

Discussione
Lo studio ha dimostrato che la tecnica HACCP si è rilevata idonea a migliorare l’efficienza della GMP-facility, destinando risorse umane e tecnologiche solo là dove è necessario, nel momento opportuno e con modalità efficaci, riducendo i costi di un’attività molto onerosa. Inoltre lo studio evidenzia i vantaggi di allestire un Laboratorio Controllo Qualità GMP conforme e autorizzabile dall’ente regolatorio, in quanto migliora l’efficacia e l’efficienza delle fasi di messa a punto del sistema e delle fasi di produzione, contribuendo al miglioramento continuo del prodotto cellulare e alla progettazione e sviluppo di futuri farmaci innovativi.

40 - CELLULE STAMINALI ENDOGENE ED ESOGENE PER CONTRASTARE LA MORTE CELLULARE NELLE DISTROFIE MUSCOLARI
Sampaolesi M.
Sezione di Anatomia Umana, Università degli studi di Pavia

Le distrofie muscolari sono un gruppo di malattie caratterizzate da degenerazione muscolare che compromette la motilità dei pazienti. Spesso anche il tessuto cardiaco risulta compromesso. Nuove strategie per il trattamento di queste malattie sono attualmente in fase di studio ed essenzialmente prevedono l'attivazione e il potenziamento di cellule staminali endogene o il trapianto di cellule staminali esogene. Diversi tipi cellulari sono stati identificati per la loro capacità di riparare il muscolo scheletrico e cardiaco tra cui i mesoangioblasti (Mabs), cellule staminali associati ai vasi. La capacità differenziativa tessuto specifica dei Mabs è stata ben documentata in diversi modelli animali, mentre l’alterazione dell’espressione dei microRNA, (RNA composti da circa 22 nucleotidi e in grado di regolare l'espressione dei geni) evidenziata nei Mabs cardiaci distrofici rivela una complessità biologica di segnali differenziativi ma anche un potenziale target terapeutico per la correzione o il potenziamento di queste cellule. Nella distrofia muscolare e nelle cardiomiopatie l’ipertrofia tissutale è un primo evento di compensazione che poi lascia il campo all’inesorabile degenerazione funzionale del tessuto. Diverse molecole sono coinvolte nell’ipertrofia muscolare tra cui la proteina ricombinante, Magic-F1. La natura del segnale biochimico trasdotto da Magic-F1 spiega le caratteristiche funzionali esclusive della proteina ricombinate, come citochina trofica priva di attività mitogenica ed in grado di contrastare i fenomeni apoptotici nella rigenerazione muscolare. I risultati ottenuti in vitro  sono stati confermati dall’analisi in modelli transgenici murini che esprimono la proteina nel muscolo scheletrico. I muscoli dei topi transgenici presentano, infatti, a seguito di un danno muscolare, una   diminuzione dei processi apoptotici nel tempo, rispetto al controllo.
In entrambe i casi riportati, proteine ricombinanti e microRNA agiscono in vie di segnale che possono determinare un effetto antiapoptotico e promuovere una corretta rigenerazione del tessuto muscolare.

References
Quattrocelli M et al. Cell therapy strategies and improvements for muscular dystrophy.
Cell Death Differ. 2009 Oct 30. [Epub ahead of print]

Ringraziamenti:
Hanno collaborato: Marco Cassano, Stefania Crippa,  Mariana Lo perfido, Mattia Quattrocelli

41 - LE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI COME MODELLO PER LO STUDIO DELLE DIFFERENZIAZIONE CARDIOMIOCITARIA
Cerbai E.
Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e Biofisica Applicata, C.I.M.M.B.A., Dipartimento di Farmacologia, Università degli Studi di Firenze)

Le cellule staminali embrionali (ES)  rappresentano una sorgente cellulare con elevate potenzialità terapeutica per la rigenerazione del tessuto cardiaco danneggiato ed un utile modello per indagare i meccanismi fisiologici di base del differenziamento e maturazione cardiaca. Tale duplice rilevanza delle cellule ES deriva dalla loro comprovata abilità di differenziare verso il fenotipo cardiaco sia in-vitro che in-vivo. Il processo di differenziamento è guidato dall’attività di una rete di geni responsabili per la specificazione cardiaca e che a loro volta sono regolati in maniera tempo-dipendente da fattori sierici presenti all’interno del mezzo di crescita. Uno di tali fattori è rappresentato dalla serotonina (5-HT), in grado di agire come fattore morfogenetico cardiaco attraverso l’attivazione dei recettori di tipo 5-HT2. Inoltre, evidenze sperimentali suggeriscono che la 5-HT possa avere un ruolo indipendente dall’attivazione recettoriale, in quanto essa è attivamente captata dai cardiomiociti in via di sviluppo e metabolizzata a livello intracellulare. Nel complesso, vie di segnalazione recettoriali e non recettoriali descrivono le proprietà morfogenetiche della 5-HT e confermano ulteriormente l’utilità distintiva delle cellule ES come modello di studio della differenziazione cardiomiocitaria.

42 - MSC ISOLATION AND CHARACTERIZATION IN PATIENTS AFFECTED BY AUTOIMMUNE DISEASES
Mazzanti B., Ballerini C.*, Aldinucci A.*, Dal Pozzo S., Saccardi R.
Haematology Department and CBB Florence, Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi, Florence
*Neuroimmunology Department, University of Florence

Stem cell therapy, traditionally applied to haematopoietic disorders, is now developed for the treatment of other diseases like autoimmune diseases. Over the last decade, haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) has been successfully used in the treatment of severe progressive autoimmune diseases like multiple sclerosis (MS) (Saccardi et al., 2006). Other than HSC, bone marrow (BM) contains stromal cells identified as mesenchymal stem cells (MSC).
The potential of MSC to differentiate in several tissue along with their in vitro immunomodulatory capacity and their efficacy in preclinical models,  raised the possibility of autologous cell transplantation for the treatment of autoimmune diseases (AD).
In addition, BM derived MSC can be rapidly expanded to numbers that are required for clinical applications. In this perspective it seems crucial to study the characteristics of MSC isolated from AD patients prior to a potential clinical application. In particular our data on MSC isolated from Multiple Sclerosis patients will be discussed. MSC obtained from MS patients and  healthy donors (HD) were compared in terms of phenotypical and functional characteristics. We show that MSC isolated from MS and HD differ significantly for IP10 production. Therefore, although MSC isolated from MS patients exhibit the same properties of HD MSC in terms of proliferation, phenotype, in vitro differentiation, TLRs expression, immunosuppressive ability, inhibition of DCs differentiation and activation, the use of autologous MSC in cell therapy of autoimmune diseases should be submitted to attentive evaluation.

43 - SPHINGOSINE 1-PHOSPHATE INDUCES DIFFERENTIATION OF MESOANGIOBLASTS TOWARDS SMOOTH MUSCLE CELLS
Donati C.1,2, Marseglia G.3, Magi A.3, Cencetti F.1,2, Bernacchioni C.1,2, Benelli M.3, Brunelli S.4,5, Torricelli F.3, Cossu G. 4,6, Bruni P.1,2
1Dipartimento di Scienze Biochimiche, Università di Firenze, 50134 Firenze, 2Istituto Interuniversitario di Miologia (IIM), 3 Unità Operativa Citogenetica e Genetica, Azienda Ospedaliera Universitaria, 50134, Firenze,  4Stem Cell Research Institute, Istituto Scientifico H San Raffaele, 20132 Milano; 5Dipartimento di Medicina Sperimentale, Università di Milano-Bicocca, 20052 Monza, Italia; 6Dipartimento di Biologia, Università di Milano, 20130 Milano, Italia

Smooth muscle cells (SMCs) control many fundamental functions such as arterial tone, airway resistance, gastrointestinal and genitourinary tract contractility; alterations of vascular smooth muscle cells contribute to a number of major diseases in humans including atherosclerosis, cancer and hypertension. Unlike either skeletal or cardiac muscle cells that are terminally differentiated, SMCs retain remarkable plasticity. A number of relatively recent studies have provided evidence showing that circulating, SMC progenitor cells can contribute to neointima formation and repair following vascular injury [1]. Mesoangioblasts are a new type of stem cells, isolated from explants of dorsal aortha, capable of differentiating into many mesoderm cell types, such as smooth and striated muscle, bone and endothelium. When delivered through the arterial circulation, mesoangioblasts significantly restore skeletal muscle structure and contribute also to the repair of cardiac muscle [2]. The sphingolipid metabolite sphingosine 1-phosphate (S1P) is a lipid mediator that regulates a wide number of fundamental biological processes mainly through the binding to its specific receptors S1PR1-5. Complexity in S1P signalling is increased by the fact that endogenous S1P is mediator of the biological actions of a number of growth factors and cytokines. S1P has recently been shown to have important effects on vascular development and SMC growth and migration, stimulating angiogenesis and inducing vessel  maturation in many model systems [3]. We previously demonstrated that S1P acts as potent mitogen and antiapoptic agent in murine and human mesoangioblasts [4]. Supporting the important role of sphingolipid metabolism, we also recently showed that TGFb exerts a marked antiapoptotic action in mesoangioblasts with a mechanism involving regulation of SphK1 [5]. In order to completely utilize the therapeutic potential of these cells, with the aim of fully individuating the pleiotropic biological action of S1P, we performed a microarray study to establish transcriptional profiles of human mesoangioblasts treated with 1µM S1P for 6 h and 24 h. Obtained results, validated by Real time PCR, Western blot and immunofluorescence analysis, demonstrate for the first time that S1P promotes differentiation of human mesoangioblasts towards SMC by enhancing the expression of myogenic marker proteins, such as calponin-1, tropomyosin-1, transgelin, etc. Moreover, we present evidence that TGFb-induced differentiation of mesoangioblasts into SMC relies on SphK regulation, since pharmacological inhibition of the enzyme impaired the ability of the cytokine of increasing the expression levels of myogenic markers. Analogous findings were obtained in murine mesoangioblasts.
This study individuates an important role of S1P in mesoangioblasts which can be exploited to favour vascular regeneration.

[1] Owens GK, Kumar MS, Wamhoff BR. (2004)
[2] Cossu G, Bianco P. (2003)
[3] Pyne, S., Pyne, N. J. (2000)
[4] Donati, C., Cencetti, F., Nincheri, P., Bernacchioni, C., Brunelli, S., Clementi, E., Cossu, G., Bruni, P. (2007)
[5] Donati C, Cencetti F, De Palma C, Rapizzi E, Brunelli S, Cossu G, Clementi E, Bruni P. (2009)

44 - THE REXINOID 6-OH-11-O-HYDROXYPHENANTRENE INDUCES APOPTOSIS OF HUMAN OSTEOSARCOMA AND MESENCHYMAL STEM CELLS
Dozza B.a, Papi A.b, Lucarelli E.a, Pierini M.a, Donati D.a, Orlandi M.b
a)Modulo di Rigenerazione Tissutale Ossea, Via di Barbiano 1/10, Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna
b)Dipartimento di Biologia Evoluzionistica, Via Selmi 3, Università degli Studi di Bologna, Bologna

Introduction and Aim
Rexinoids are known to exert cytotoxic effects against several types of cancer cells. This study was to assess whether the rexinoid 6-OH-11-O-hydroxyphenantrene (IIF) possesses significant cytotoxic effects against osteosarcoma (OS), a malignant bone tumor in children, and mesenchymal stem cells (MSC) .

Methods and results
Different human OS cell lines and MSC were exposed to increasing concentration of IIF and retinoic acid (RA) up to 72 hours to test growth inhibition and apoptosis by methylen blue assay and flow cytometry, respectively. Results showed a time- and dose- dependent decrease of OS cells and MSC following IIF treatment. Among the OS cell lines tested, Saos-2 and MG-63 were more sensitive to IIF compared to U2OS. In particular 80 mM IIF induced a decrease of ~50% and ~40% of Saos-2 and MG-63 cells, respectively, compared to time-matched control within 24 hours. 80 mM IIF induced also the growth arrest of MSC. No effect on cell proliferation was detected following RA treatment. In addition, Annexin V and propidium iodide staining showed that IIF treatment led to an increase of OS cells and MSC in the necrotic/late apoptotic and apoptotic fraction.
Treatment with IIF for 24 hours was accompanied by decrease of antiapoptotic protein Bcl2, while simultaneously pro-apoptotic Bax level increased in all three OS cell lines tested as revealed by Western blot analasys. IIF increased Bax level in a dose-dependent manner also in MSC. Moreover a caspase 9 activation demonstrated a mitochondrial pathway in apoptosis induction of IIF in OS and MSC cells.

Discussion
Collectively, our results demonstrated that IIF by itself is a strong antiproliferative and proapoptotic inducer. In previous works we demonstrated the remarkable antitumoral activity of IIF in different cancer cells; these results confirm that IIF may be an effective compound for anticancer treatment, including osteosarcoma cell lines. In addition IIF could prevent metastases through the mesenchymal cell inhibition.

45 - RIGENERAZIONE DEL TESSUTO OSSEO NELLA PSEUDOARTROSI CONGENITA DELLA TIBIA MEDIANTE L’IMPIEGO DI CELLULE STROMALI MIDOLLARI AUTOLOGHE: STUDIO PRECLINICO
Devescovi V.a, Baglìo S.R.a, Leonardi E.a, Donzelli O.b, Magnani M.b, Giunti A.a, Baldini N.a, Granchi D.a
a)Laboratorio di Fisiopatologia Ortopedica e Medicina Rigenerativa
b)Ortopedia e Traumatologia Pediatrica, Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna, Italia

INTRODUZIONE
La pseudoartrosi congenita della tibia (PCT) è una malattia rara, spesso associata a neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), caratterizzata da fratture spontanee che non guariscono. I ripetuti fallimenti chirurgici portano spesso all'amputazione. Un approccio di tipo rigenerativo che sfrutti il potenziale osteogenico delle cellule stromali mesenchimali (MSC), potrebbe favorire la riparazione del tessuto osseo.

SCOPO:
L’obiettivo è stato quello di studiare in vitro la capacità osteogenica delle MSC di soggetti affetti da PCT e valutare se il microambiente in cui i precursori vengono trapiantati può alterarne potenziale rigenerativo.

PAZIENTI E METODI
Sono stati reclutati 7 pazienti affetti da NF1 e PCT (PCT_NF1+), 6 con PCT senza NF1 (PCT_NF1-) e 4 pazienti di controllo. Le MSC sono state isolate da midollo osseo raccolto vicino alla lesione pseudoartrosica (P) e dalla cresta iliaca (IC). Il differenziamento osteoblastico è stato indotto in terreno con siero bovino fetale (FBS) o autologo (AUT), acido ascorbico, desametasone, e β-glicerofosfato. Da biopsie ossee ottenute dalla lesione sono state allestite colture di osteoblasti (OB), il cui sovranatante (OB-CM) è stato usato in esperimenti di cocoltura. Il potenziale osteogenico delle MSC è stato saggiato misurando la proliferazione, la formazione di colonie, la produzione di fosfatasi alcalina (ALP), la deposizione di noduli minerali, il rilascio di calcio e l’espressione di geni del differenziamento osteoblastico. 

RISULTATI e DISCUSSIONE
Le IC-MSC ottenute da pazienti con PCT risultano più osteogeniche delle P-MSC, ma meno di quelle del gruppo di controllo. Il difetto è più marcato nei pazienti con NF1 forse a causa dell’alterazione del gene della neurofibromina, proteina con un ruolo essenziale nello sviluppo scheletrico. Il siero AUT inibisce la formazione di noduli minerali e l’espressione di geni della matrice nel gruppo PCT_NF1-. Tuttavia in alcuni casi di NF1 la funzionalità delle P-MSC è risultata migliore impiegando il siero AUT, suggerendo che fattori di crescita circolanti potrebbero compensare il difetto costituzionale. Infine OB-CM non ostacola il differenziamento delle IC-MSC, e sia nel gruppo PCT_NF1- che in quello di controllo favorisce l’espressione di geni del differenziamento.

CONCLUSIONI
L’uso di MSC autologhe potrebbe essere uno strumento utile per il trattamento di PCT ricorrenti, aumentando le possibilità di ottenere la rigenerazione ossea. Studi clinici sono necessari per confermare la reale efficacia di un approccio rigenerativo rispetto alla terapia standard.

Ringraziamenti: Il progetto è stato finanziato con fondi dell’Istituto Superiore di Sanità (Programma Italia-USA, Malattie Rare) e dall’Associazione ONLUS ‘Io ci sono’.

46 - DEGENERAZIONE DEL DISCO INTERVERTEBRALE: STUDIO DEGLI ASPETTI ISTOLOGICI E MOLECOLARI PER UNA TERAPIA INNOVATIVA
Leonardi E.1, Ciapetti G.1, Devescovi V.1, Granchi D.1, Baldini N.1, Greggi T.2, Lulli M.3, Di Gesualdo F.3, Capaccioli S.3
1Laboratorio di Fisiopatologia Ortopedica e Medicina Rigenerativa, Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna - 2SSD Chirurgia delle Deformità del Rachide, Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna - 3Dipartimento di Patologia and Oncologia Sperimentale, Università di Firenze - Phoenix ONLUS Stem Cell Foundation for Human Life

Introduzione
La degenerazione del disco intervertebrale inizia con l’invecchiamento, può essere accelerata da fattori genetici o ambientali, e si manifesta clinicamente nella quinta decade di vita. Inoltre, è causa frequente di dolore lombare e implica spesso il ricorso a terapie mediche o chirurgiche. A livello biologico, molte cellule del disco muoiono per apoptosi, mentre la matrice discale viene aggredita dalle metalloproteinasi (MMP), la cui attivazione dipende in larga parte dalla plasmina.

Scopi: Caratterizzare il tessuto discale, analizzando le differenze tra anello fibroso e nucleo polposo. Mettere a punto un sistema di coltura in vitro per l’espansione di cellule del disco e lo studio di terapie cellulari innovative. Testare l’impiego di un oligonucleotide antisenso diretto contro uPAR, per bloccare l’attivazione della plasmina e la conseguente produzione di MMP o l’utilizzo di cellule stromali mesenchimali (MSC) per la rigenerazione di tessuto funzionale.

Metodi
Il tessuto discale è stato raccolto durante interventi di discectomia. L’analisi istologica è stata condotta mediante colorazioni specifiche per la matrice extracellulare, per evidenziare fibre collagene e proteoglicani. Le cellule da biopsia discale sono state isolate ed espanse in coltura e l’espressione di geni del pattern osteo/condrogenico è stata analizzata in real time PCR. MSC sono state isolate da corpo vertebrale e il loro potenziale proliferativo e differenziativo è stato verificato.

Risultati
Istologicamente sono stati riscontrati disorganizzazione della matrice, aumentata componente collagenica e aumentata vascolarizzazione; nessuna correlazione della degenerazione con età e sesso del paziente o capacità proliferativa delle cellule in vitro è stata osservata. Anche a livello molecolare si evidenzia una ridotta espressione dei geni del differenziamento condrogenico a favore di un aumento del collagene I nelle cellule del nucleo polposo. Il sistema tridimensionale di coltura in micromassa ha mostrato di poter favorire un’attiva proliferazione cellulare e la sintesi di matrice. Infine è stata confermata la possibilità di espandere in vitro anche MSC da corpo vertebrale e differenziarle in senso osteogenico.

Discussione
L’osservazione della struttura del tessuto discale degenerato, la caratterizzazione delle sue cellule e un efficiente sistema di coltura in vitro costituiscono la premessa per approfondire lo studio dei meccanismi molecolari alla base del processo di degenerazione del disco e di strategie innovative per terapie biologiche. Ci si propone, da un lato, di ridurre la degenerazione tissutale bloccando le MMP o inibendo l’apoptosi cellulare e, dall’altro, di indurne la rigenerazione tramite l’azione trofica e il potenziale differenziativo delle MSC.