Testi internazionali di biologia molecolare, reviews scaricabili da riviste internazionali specializzate e le diapositive presentate a lezione e distribuite durante il corso
Obiettivi Formativi
ANALISI PROTEINE
Gli studenti acquisiscono i concetti di base riguardo alle metodologie di separazione e di analisi qualitativa e quantitativa delle proteine in campioni biologici: cellule, tessuti, fluidi biologici.
Vengono in particolare approfondite le tecniche per l’analisi delle proteine mediante elettroforesi su gel mono e bidimensionale associata a DIGE. Principi di spettrometria di massa associati ad analisi proteomica.
Le lezioni pratiche integrano in particolare l’analisi preparativa per elettroforesi monodimensionale.
IMMUNOLOGIA
Gli studenti acquisiscono i concetti di base riguardo alle metodologie per purificare le diverse popolazioni cellulari ed in particolare i tipi leucocitari presenti nel sangue periferico.
Vengono fornite inoltre le principali nozioni biologiche riguardanti le cellule dendritiche ed i linfociti T, con particolare enfasi agli aspetti inerenti la loro coltura in vitro.
FONDAMENTI DI MICROSCOPIA-
Gli studenti acquisiscono i concetti di base riguardo il funzionamento del microscopio ottico, del microscopio elettronico a trasmissione e di alcuni microscopi ottici definiti di “nuova generazione” quali il microscopio confocale a scansione laser ed quello ad eccitazione a due fotoni. In particolare, vengono introdotti i principi teorici di base e le tecniche di allestimento dei preparati biologici per la microscopia ottica, elettronica a trasmissione, DIC, confocale a scansione laser e a eccitazione a due fotoni. Vengono fornite, inoltre, alcune nozioni di base riguardo l’allestimento e l’utilizzo delle colture cellulari sia primarie che stabilizzate. Verranno acquisite anche abilità e autonomie relative alle esperienze in laboratorio
Prerequisiti
nessuno
Metodi Didattici
LEZIONI FRONTALI
ESERCITAZIONI PRATICHE IN LABORATORIO
Modalità di verifica apprendimento
verifica orale sulle competenze in ambito proteomico, immunologico, microscopico
Programma del corso
ANALISI PROTEINE
Argomento 1: Tecniche di analisi delle proteine
Vengono introdotte le principali tecniche di analisi delle proteine su campione fissato e su campione estratto: immunocito- e istochimica, autoradiografia ed analisi in fluorescenza di imaging.
Array proteici su matrice. Tecnica di immunorealtime PCR per lo studio ultrasensibile delle proteine. Tecniche specifiche per lo studio dell’interazione fra proteine: immunoprecipitazione, yeast 2 hybrid assay, FRET.
Argomento 2: Analisi proteomica
Viene in particolare trattato l’approccio di analisi proteomica mediante tecnica di separazione mediante elettroforesi mono e dimensionale, analisi DIGE e analisi Western Blot. Dosaggio del contenuto proteico di un campione. Vengono illustrati esempi di ricerche sperimentali che sfruttano tale approccio proteomico. Concetto e sfruttamento della reazione antigene anticorpo per l’analisi proteica.
Argomento 3: Tecniche ELISA e Bioplex
Vengono illustrati i principi delle tecniche per l’analisi qualitativa e quantitativa contemporanea di più proteine in miscele in sospensione mediante reazione multiplex, con i relativi esempi applicativi.
IMMUNOLOGIA
Argomento 1: Purificazione cellulare da sangue periferico:
Viene introdotta la stratificazione su gradiente di densità (ficol) e la tecnica di separazione immunomagnetica basata sull’utilizzo di anticorpi monoclonali specifici per antigeni cellulari di superficie, coniugati a microbiglie ferromagnetiche.
Argomento 2: Coltura delle cellule dendritiche: vengono introdotti gli aspetti classificativi e le principali caratteristiche fenotipiche e funzionali delle cellule dendritiche. Quindi vengono illustrate le metodiche di coltura per generare le cellule dendritiche da precursori monocitari o da cellule ematopoietiche staminali
Argomento 3: Colture linfocitarie T: Dopo un breve riepilogo delle principali caratteristiche funzionali dei linfociti T, vengono introdotte le metodiche necessarie per la generazione di linee linfocitarie T specifiche per antigeni e la tecnica di clonazione dei linfociti T attraverso diluizione limite e successiva semina in piastra.
FONDAMENTI DI MICROSCOPIA-
Argomento 1: Microscopio ottico e microscopio elettronico a trasmissione: principi di funzionamento e allestimento di campioni biologici.
Argomento 2: Microscopi ottici di ‘nuova generazione’: microscopio confocale a scansione laser, microscopio ad eccitazione a due fotoni. Principi di funzionamento, allestimento di preparati biologici, tecniche di immunofluorescenza confocale. Analisi di immagine.
Argomento 3: Colture cellulari: principi generali e metodiche di base.